高效液相色谱法在贻贝黏蛋白检测中的应用

柯林楠 宋茂谦 高敏 陆云龙 母瑞红*

1 中国食品药品检定研究院 （北京 100050）

2 江阴贝瑞森生化技术有限公司 （江苏 无锡 214437）

内容提要： 目的：建立高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鉴别检测贻贝黏蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）的方法。方法：采用Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流动相为0.1%三氟乙酸水溶液（A）和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液（B）梯度洗脱，检测波长280nm，洗脱温度25°C，流量为0.9mL/min。进样量20μL。考察方法的系统适用性、线性、精密度、检测限及定量限。结果：贻贝黏蛋白供试样品与对照品的HPLC图谱一致。贻贝黏蛋白在0.01～9.79mg/mL范围内峰面积与其浓度呈良好的线性关系(r=1)，峰面积及保留时间RSD均小于5%，最低定量限（LOQ）为0.03mg/mL，最低检出限（LOD）为0.01mg/mL。结论：该方法专属性强，稳定性好，简单易用，适用贻贝黏蛋白的检测。

贻贝是一种能在淡水和海洋环境中附着在如岩石、船体、缆绳等固体表面上和生物表面的海洋生物，可以分泌一种具有卓越黏附性的蛋白质，即贻贝黏蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）。贻贝黏蛋白具有多巴胺特殊的组成和结构以及优良的黏附特性，其黏合范围广、耐海水腐蚀、强度高、生物亲和性良好，可作为环境友好型胶黏剂，应用于带水条件下的黏合，该特性在医疗领域具有广泛的应用前景。韩国科学家借鉴贻贝能在水下附着的原理，已经研制出一种光活化的以贻贝蛋白为基础的生物胶黏剂[1]。美国西北大学的研究人员正在开发一种与众不同的源自贻贝蛋白的涂层，用于改良医用植入物的生物相容性，并能更好地防止危及生命的血栓和细菌感染[2]。我国贻贝黏蛋白医疗器械、美容产品等领域的研发和在创面修复、肛肠黏膜损伤、皮肤敏感瘙痒等临床的应用已有报道[3-9]。

贻贝黏蛋白获取方法主要是直接从贻贝足腺中提取天然黏附蛋白成分，因此，作为医疗产品时，贻贝黏蛋白的纯度和含量是含贻贝黏蛋白的医疗器械质量控制的关键技术指标，开发精准的测量方法对产品质量控制具有重要的意义。蛋白的测定方法通常有电泳法、分光光度法、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等。电泳法可通过分子量和分子结构将贻贝黏蛋白与杂蛋白分离进行定性和定量，但操作复杂；而分光光度法因专属性不强无法用于复杂体系中单体成分的测定。HPLC因具有分离效果好、分析速度快、样品回收简单、灵敏度高，方法灵活等特点，已广泛地应用于医药、食品、化妆品等多专业领域的检测，但在贻贝黏蛋白纯度检测方面的应用未见报道[10-13]。本研究采用HPLC方法对贻贝黏蛋白纯度进行检测，以期为贻贝黏蛋白医疗产品质量控制提供技术支持。

1.材料与方法

1.1 一般资料

供试样品：由江苏江阴贝瑞森生化技术有限公司生产，不同批次纯化所得的贻贝黏蛋白半成品，在4～8 C下存储。贻贝黏蛋白对照品：采用市售的高纯度试剂作为本研究的对照品，MAP-04012，细胞培养级纯度，浓度为1mg/mL乙酸水溶液，美国ACROBiosystems公司。

仪器设备：①高效液相色谱仪：岛津LC-15C，包括泵送系统（LC-15C）、自动进样器（SIL-16）和探测器（SPD-15C），并配装Labsolution软件。②紫外可见分光光度计：UV-2401PC，岛津公司，日本。

1.2 色谱条件

Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250mm）色谱柱。检测波长280nm，洗脱温度25°C，流速为0.9mL/min，进样量20μL。

2.结果与讨论

2.1 色谱条件选择

2.1.1 检测波长

采用紫外可见分光光度计在200～900nm对贻贝黏蛋白溶液进行全波长扫描，结果如图1所示。图中显示：在波长200～250nm范围内有较强吸收，但该范围内吸光度变化快，易存在溶剂干扰，影响检测结果的稳定性。在280nm处吸收较大且受溶剂干扰较小，因此，确定280nm为贻贝黏蛋白的HPLC分析方法的检测波长。

图1.贻贝黏蛋白溶液全波长扫描图

2.1.2 流动相的选择

贻贝黏蛋白分子上的羟基易与色谱介质之间产生离子作用，造成色谱峰拖尾，通常在流动相中加入酸来抑制这种离子间作用。为测定提取液中的贻贝黏蛋白，考察了乙腈：水：乙酸、乙腈：水：磷酸和乙腈：水：三氟乙酸三种体系为洗脱剂，在1.2的液相色谱条件和梯度洗脱程序为0～8min时5%～12%B，8.01～20min时15%B，20.01～45min时15%～100%B的测试结果，对各流动相体系同一测试样品的色谱峰峰形、分离状况和保留时间等进行了分析对比，选择合适流动相体系。采用乙腈：水：乙酸体系为流动相时，样品色谱峰峰形不对称、分离情况不好；采用乙腈：水：磷酸体系为流动相时，样品色谱峰峰形有所改善；采用乙腈：水：三氟乙酸体系为流动相时，样品色谱峰峰形进一步改善，对称性好，目标色谱峰的理论塔板数和分离状况均优于前两种洗脱体系，选定乙腈：水：三氟乙酸体系，即0.1%三氟乙酸水溶液（A）和含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（B）为本研究的流动相。

2.1.3 系统适应性

取1.0mg/mL对照品溶液按1.2色谱条件进样测定，保留时间29.4min，贻贝黏蛋白峰的拖尾因子（T）为1.12，反映了峰的对称性较好。主峰及其邻近峰的分辨率（Rs）为2.1，表明贻贝黏蛋白与其他蛋白质的分离性较好。理论塔板数（N）为5015，表明塔柱效率较高。该方法系统适应性符合《中华人民共和国药典2015年版 四部》[14]HPLC的要求。

2.2 对照品与供试样品的HPLC谱图比较

精密量取贻贝黏蛋白浓度为1mg/mL的对照品溶液与供试样品（MAP15041908，浓度1mg/mL）溶液在相同条件下进行测定，所得的HPLC谱图，如图2所示。

图2.供试样品与对照品HPLC 谱图（实线：供试样品；虚线：对照品）

从图中看出，供试样品和对照品在保留时间、主峰位置和形状一致，表明该峰为贻贝黏蛋白色谱峰。说明该方法对贻贝黏蛋白具有特异性，可以用于贻贝黏蛋白的检测鉴定。

2.3 线性

贻贝黏蛋白原液：批号为16072315-A，纯度为99.76，浓度为9.79mg/mL。

用0.005%的乙酸盐溶液将纯化的贻贝黏蛋白原液在0.01～9.79mg/mL范围稀释至不同浓度，制备成系列测试液进行测定，记录色谱图，以浓度为横坐标（X），主要峰面积为纵坐标（Y）绘制线性回归曲线，图3 所示，r2=1，斜 率=2.457e+006±2295，截 距=-25081±9110。表 明 在0.01～9.79mg/mL浓度范围内，峰面积和贻贝黏蛋白浓度呈良好的线性关系。

图3.峰面积与贻贝黏蛋白浓度的关系图

2.4 精密度

取贻贝黏蛋白半成品，记录批号、浓度和纯度，用0.005%的乙酸盐溶液分别稀释至1.5mg/mL作为供试液进行测定，记录纯度、保留时间和峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。根据实验结果评价方法的精密度，测试结果的纯度在标称纯度的90%～110%范围内，RSD 应＜5%，保留时间应在29～31min，则符合该方法精密度要求。

2.4.1 重复性

供试贻贝黏蛋白样品：批号为16050502-A，标示纯度为95%，浓度为11.17mg/mL。将供试样品用0.005%的乙酸盐溶液稀释制备供试液，重复测定6次，结果见表1。结果显示供试样品纯度平均值为96.4%，为标示纯度的101%，所有参数的RSD均＜5%，保留时间为30.1min，显示该方法重复性良好。

表1.重复性实验的结果

2.4.2 重现性

通过测定同批次不同浓度的样品和相同浓度不同批次的样品的纯度、保留时间的RSD值评价重现性。

同批次不同浓度样品测定：将标示纯度99.76%，批号16072315-A的贻贝黏蛋白样品，分别稀释至0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL进行测定，结果：纯度的RSD为3.6%，保留时间的RSD为0。

相同浓度不同批次样品测定：分别将标示纯度99.76%，批号16072315-A；标示纯度97.98%，批号16070301-A；标示纯度91.2%，批号15042211-A的样品稀释至1.5mg/mL，进行测定，结果：纯度和保留时间RSD分别为1.26%和0.4%。

上述同一批号的样品稀释至不同的浓度，不同的批号稀释至相同浓度，测定纯度和保留时间的RSD值均低于5%，表明了该方法具有重现性。

良好的重复性和重现性测定结果表明：该方法精密度符合要求。

2.5 检测限LOD和定量限LOQ

将空白样本溶液注入6次进行测定，得到的峰面积为噪声值。LOD 为噪声值的3 倍，而LOQ 为噪声值的10 倍。结果为LOD为0.01mg/mL，而LOQ为0.03mg/mL。

2.6 稳定性

通过微小的改变色谱条件对贻贝黏蛋白测定造成的影响来验证。本研究使用不同批次的流动相和不同的柱温测试分别对样品进行分析，RSD均为零，表明了该方法具有稳定性。

3.结论

建立的HPLC检测贻贝黏蛋白纯度方法，色谱分离好，专属性强，稳定性好，系统适应性符合《中国药典》HPLC的要求，方法简便易行，适用于含贻贝黏蛋白类医疗器械中贻贝黏蛋白的鉴别检测。