肠道病毒71 型病毒样颗粒疫苗抗原检测方法的建立及验证

施歌，石亮，王翠艳，白鹭，褚彦飞，史赫，谷铁军，刘大维，包小华

1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.长春百克生物科技股份公司吉林 长春 130062；3.京天成生物技术（北京）有限公司，北京 100089；4.吉林大学生命科学学院，吉林 长春 130012；5.中国人民解放军联勤保障部队第964 医院，吉林 长春 130000

手足口病（hand，foot，mouth disease，HFMD）是近几十年在全世界特别是亚太地区广泛流行的高传染性疾病。在我国HFMD 主要由肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）及柯萨奇病毒A 组16 型（coxsackie virus，CVA16）感染引发，其中EV71 属于小核糖核酸病毒科肠病毒属的一类微小单链病毒［1］，该病毒可通过日常接触传播，5 岁以下婴幼儿及学前儿童极易感染。EV71 感染有不同的临床表现，部分人可呈隐性感染［2-3］。接种疫苗是预防EV71 感染的有效手段，目前我国已有EV71 灭活疫苗上市，但无EV71 病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗上市。VLP 与天然病毒有类似结构但不含病毒遗传信息，具备独特的安全性、免疫原性及可被精准修饰等优势，因此被用于研制多种疫苗［4-7］，如乙型肝炎病毒VLP 疫苗及人乳头瘤病毒VLP 疫苗已成功上市，EV71 VLP 疫苗也已成为研究热点，并初步具备了进行临床研究的条件［7-8］。

ELISA 法是实验室检测免疫学指标最常用的方法，也是疫苗抗原含量检测的重要手段，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、重复性好，且成本低、环保等其他优势［9］。本研究参考其他疫苗使用ELISA方法检测抗原含量的经验［10-12］，通过免疫日本大耳白兔制备抗EV71 VLP 多克隆抗体，并对多克隆抗体包被浓度和酶标抗体稀释倍数进行优化，初步建立了检测EV71 VLP 抗原含量的双抗体夹心ELISA法，并且为确保已建立的检测方法适用于EV71 VLP疫苗抗原的质量控制，对方法的准确度、精密度、线性范围和定量限进行了验证［13-14］，以期为EV71 VLP疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 普通级日本大耳白兔2 只，雌性，100 ~ 110 日龄，体重2.0 ~ 2.3 kg，购自北京隆安实验动物养殖中心，动物合格证号：SCXK（京）2019-0006。本实验均以科研为目的进行白兔的养殖和使用，并按照实验动物福利伦理审查指南的相关规定进行（GB ／ T 35892-2018）。

1.2主要试剂及仪器 EV71 VLP（0.4 mg ／ mL）由长春百克生物科技股份公司制备；EV71 抗原国家标准品（1 600 U ／ mL，批号：20101701）购自中国食品药品检定研究院；牛血清白蛋白（BSA）购自北京酷来搏科技有限公司；HRP 标记的羊抗兔二抗购自美国Jackson Immuno Research 公司；抗EV71 P1 HRP 标记抗体由吉林大学生命科学学院艾滋病国家工程实验室提供；底物A 液、B 液购自北京勤邦生物技术有限公司；酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；紫外分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司；Protein A 亲和层析柱购自江苏金斯瑞生物科技有限公司。

1.3EV71 VLP 兔多克隆抗体的制备

1.3.1动物免疫 按照京天成生物技术（北京）有限公司实验动物免疫程序，以EV71 VLP 作为免疫原，背部皮下免疫日本大耳白兔，6 mL ／ 只，1 周后采用相同方法进行加强免疫，共加强免疫3 次，末次免疫1 周后心脏采血。

1.3.2兔血清抗体效价检测 用EV71 VLP 包被酶标板（1 μg ／ mL），100 μL ／ 孔，4 ℃过夜；PBS 洗板3 次，加入5% milk-PBS，200 μL ／ 孔，室温封闭1 h；PBS 洗板1 次，加入兔血清（用5% milk-PBS 按1 ∶1 000、1 ∶5 000、1 ∶10 000、1 ∶50 000、1 ∶100 000 稀释），100 μL ／ 孔，室温反应1 h；PBS 洗板3 次，拍干，加入HRP 标记的羊抗兔二抗（1 ∶2 000 稀释），100 μL ／ 孔，室温反应1 h；PBS 洗板5 次，拍干，加入底物液（底物A 液和B 液等体积混匀），100 μL／孔，室温避光反应20 min；加入终止液，50 μL ／ 孔，混匀，上酶标仪，读取A450值。

1.3.3纯化抗体效价的检测 采用Protein A 亲和层析纯化。取1 mL 偶联A 蛋白的柱料加至空柱中，PBS 洗涤后，将1 mL 血清用9 mL PBS 稀释后上柱，然后将收集的流过液重新上柱1 次；用pH 2.7 的甘氨酸洗脱液洗脱，每1 mL 洗脱液收集1 管；用pH 1.9的甘氨酸洗脱液洗脱，每1 mL 洗脱液收集1 管。上酶标仪，读取A280值，将A280值高于0.5 的洗脱液混合后再重新测定混合液的A280值，按照1.4 的系数［15］计算抗体浓度［A280／ 1.4（mg ／ mL）］。将抗体浓度分别稀释至1、0.5、0.05、0.005 和0.000 5 μg ／ mL后，按1.3.2 项方法进行效价测定。

1.4方法的建立

1.4.1纯化多克隆抗体的筛选 将10 μg ／ mL 多克隆抗体包被酶标板，100 μL ／ 孔，4 ℃反应16 h；甩干，1 × PBS 洗涤3 次，加入封闭液，200 μL ／ 孔，室温反应1 h；拍干，分别加入EV71 抗原样品（1 000、100、1 ng ／ mL）及抗原国家标准品（1 ∶10、1 ∶40、1 ∶160 稀释），100 μL ／ 孔，37 ℃反应1 h；1 × PBS洗涤3 次，拍干，加入酶标抗体（1 ∶2 000 稀释），100 μL ／ 孔，37 ℃反应1 h；1 × PBS 洗涤3 次，拍干，分别加入底物A 液和B 液，各50 μL ／ 孔，室温避光反应10 min；加入终止液，50 μL ／ 孔，上酶标仪测定A450值。

1.4.2包被浓度与酶标抗体稀释倍数的筛选 用多克隆抗体包被酶标板，包被浓度分别为5 和10 μg／mL，酶标抗体稀释倍数为1 ∶4 000 和1 ∶10 000，采用方阵滴定法交叉检测不同浓度EV71 抗原国家标准品及EV71 VLP［12］，确定多克隆抗体包被浓度及酶标抗体稀释倍数。

1.5方法的验证

1.5.1线性范围 将EV71 抗原国家标准品分别稀释至16、8、4、2、1、0.5、0.25 U ／ mL，用建立的方法检测A450值，以抗原标准品浓度的对数值为横坐标，扣除空白背景的A450值的对数值为纵坐标，选取5点以LogX- LogY拟合方式绘制标准曲线。

1.5.2准确度 用建立的方法检测不同浓度（16、8、4、2 U ／ mL）EV71 抗原国家标准品，读取A450值，以测定值和理论值的比值计算回收率。

1.5.3定量限 将EV71 VLP 稀释至浓度范围为0.5 ～65 ng ／ mL，以PBS 溶液作为阴性对照，用建立的方法进行检测。以阴性对照A450值的2.1 倍确定方法的定量限。

1.5.4精密度 选择3 个浓度（31.250、15.625、7.813 ng ／ mL）的EV71 VLP，用建立的方法进行检测，每个浓度检测3 次，计算相对标准偏差（RSD）。

2 结 果

2.1兔血清抗体效价 初次免疫后第30 天血清样品效价检测结果见表1，1 和2 号兔血清中识别EV71 抗原的抗体效价超过1 ∶100 000，A450值＞阴性对照值的2.1 倍。

表1 初次免疫后第30 天兔血清抗体效价检测结果（A450）Tab.1 Serum antibody titer of rabbits on day 30 after primary immunization（A450）

2.2纯化抗体效价 纯化后1 和2 号兔多克隆抗体浓度分别为1.96 和2.18 mg ／ mL。稀释后多克隆抗体ELISA 检测结果显示，1 和2 号兔多克隆抗体在0.005 μg ／ mL 浓度下，A280值＞阴性对照值的2.1 倍，表明获得的多克隆抗体已达到相应浓度，见表2。

表2 纯化抗体效价检测结果（A280）Tab.2 Titer of purified antibody（A280）

2.3纯化多克隆抗体的筛选 不同梯度抗原国家标准品及EV71 抗原样品测得的A450值呈良好的梯度关系，2 号兔多克隆抗体空白A450值更低，优于1 号兔多克隆抗体，见表3。

表3 不同纯化抗体对不同抗原测试结果（A450）Tab.3 Test results of different purified antibodies against different antigens（A450）

2.4最佳包被浓度、酶标抗体浓度及方法建立 包被浓度5 μg ／ mL、酶标抗体浓度1 ∶10 000 稀释条件下，测定EV71 国家标准品、EV71 VLP 的A450值，结果显示本方法具有良好的阳性反应吸收值及线性规律，为最佳工作参数，见表4 和表5。建立的方法为：5 μg ／ mL 抗EV71 多克隆抗体包被酶标板，100 μL ／ 孔，4 ℃反应过夜；甩干，1 × PBS 洗涤3 次，加入封闭液，200 μL ／ 孔，室温反应1 h；拍干，加入不同浓度国家标准品及稀释后待测样品，100 μL／孔，37 ℃反应1 h；1 × PBS 洗涤3 次，拍干，加入1 ∶10 000 稀释的酶标抗体，100 μL ／ 孔，37 ℃反应1 h；1 × PBS 洗涤3 次，拍干，加入底物A 液和B 液，各50 μL／孔，暗处反应10 min；加入终止液，50 μL／孔，于450 nm 波长处测定A值。采用LogX- LogY拟合方式进行线性拟合。

表4 EV71 抗原国家标准品交叉测试结果（A450）Tab.4 Cross test results of national standard for EV71 antigen（A450）

表5 EV71 VLP 交叉测试结果（A450）Tab.5 Cross test results of EV71 VLP（A450）

2.5方法验证

2.5.1线性范围 抗原标准品浓度在0.5 ～8 U／mL范围内，其对数值与对应的A450值对数值呈良好的线性关系，Y= 1.063 2X- 1.106，R2= 0.992 7，见图1。

图1 EV71 抗原国家标准品反应曲线Fig.1 Reaction curve of national standard for EV71 antigen

2.5.2准确度 不同浓度EV71 VLP 检测结果的回收率为81% ～106%，符合《中国药典》三部（2020版）规定的70% ～125%，见表6。

表6 准确度验证结果Tab.6 Validation for accuracy

2.5.3定量限 EV71 VLP 抗原含量在0.5 ～65 ng ／ mL（0.507、1.015、2.03、4.06、8.12、16.25、32.5 和65 ng ／ mL）范围内的A450值分别为0.176、0.205、0.363、0.665、1.092、1.718、1.941 和2.985，空白对照A450值为0.107，确定定量限为2 ng ／ mL。

2.5.4精密度 3 个浓度（31.250、15.625、7.813ng／mL）EV71 VLP 检测结果的RSD分别为5.76%、12.04%和4.96%，见表7。

表7 精密度验证结果Tab.7 Validation for precision

3 讨 论

ELISA 法已经在EV71 灭活疫苗抗原检测中得到应用［16］。本实验通过免疫日本大耳白兔，制备了抗EV71 VLP 多克隆抗体，结果显示，抗EV71 VLP多克隆抗体能够特异性识别抗原标准品及EV71 VLP，可用于双抗体夹心ELISA 法的研发，经多克隆抗体包被、抗原结合，显色后读取A450值，经计算获得检测结果。由于多克隆抗体可能同时结合同一抗原不同结合位点，不同批次抗原的位点构象可能会存在差异，对酶标抗体与抗原结合能力的影响，尚有待进一步考察。

本实验还考察了建立方法的适用性，方法验证的目的是证明检验方法适合于相应的检测要求［17］，经验证，建立的方法具有良好的准确度、精密度、线性范围及定量限。根据美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）分析方法验证指南，重复性测试的可接受标准为RSD应不高于25%［18］，本方法精密度验证RSD在15%以下，且受被检测样品浓度的影响。因此，不同浓度样品的检测精密度可能会存在差异，针对实际生产过程中的样品需在不同稀释度下进行测试及分析。

综上所述，本实验建立了双抗体夹心ELISA 法，可用于EV71 VLP 疫苗抗原含量检测，该方法准确度高，精密度良好，可为EV71 VLP 疫苗研制中的质量控制过程提供选择。