啮齿类动物模型在新型冠状病毒肺炎治疗中的应用

孙凯丽，王如玉 综述，李新国 审校

武汉生物制品研究所有限责任公司新发传染病研究室生物安全三级实验室，湖北武汉 430207

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］引起的新型呼吸道感染疾病，主要病理变化为呼吸道和肺部出现炎症，可导致患者出现严重的呼吸问题。冠状病毒家族可影响的动物种类广泛，且病毒感染的范围取决于被感染宿主的类型。SARS-CoV-2 通过与血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体结合侵染细胞［2-3］，感染上呼吸道，进而扩散至下呼吸道。在此阶段，病毒持续复制，导致宿主细胞凋亡，Ⅰ、Ⅱ型肺细胞损伤，肺泡上皮细胞损伤导致急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），同时引起细胞因子风暴，激活其他免疫细胞参与宿主防御机制。

阐明COVID-19 的发病机制有助于对现有药物治疗效果进行比较，筛选出优良药物，找到最有效的治疗方法。易感动物模型的建立对于阐明致病机制、确定新的治疗目标以及开发和测试有效治疗方法具有十分重要的意义，其中啮齿类动物具有繁殖快、经济、易于饲养等特点，是理想的实验动物模型。

本文就SARS-CoV-2 易感啮齿类动物模型的感染情况和病理特征及其在COVID-19 治疗中的应用作一综述，以期为选择合适的易感实验动物及开发COVID-19 候选疫苗和治疗药物提供参考。

1 小鼠模型

小鼠模型广泛应用于病毒研究，但由于病毒对其的易感程度不同，通常需对小鼠进行基因修饰或病毒适应性筛选。针对SARS-CoV-2 开发的各种小鼠模型大多通过基因修饰或病毒适应性筛选获得。

1.1基因修饰小鼠模型

几种近亲繁殖的小鼠包括BALB ／ c［4］、C57BL ／6［5］以及基因缺陷型（-／-）小鼠，如重组激活基因-1（recombination activating gene-1，Rag1）-／-和信号 转导与转录激活因子1（signal transducerand activator of transcription 1，Stat1）-／-［6-8］被用来研究SARS-CoV的感染。同时有研究发现，在肺上皮细胞特异性启动子HFH4／FOXJ1 控制下，过表达人类ACE2（hACE2）的转基因小鼠也易感染SARS-CoV-2［9-10］。ACE2 是SARS-CoV 的宿主受体这一发现使研究表现人类疾病的小鼠模型成为热点［11］。由此，有科研者构建了表达hACE2 的转基因小鼠K18-hACE2，其可在回肠部位表达小鼠ACE2（mACE2）［12］。K18-hACE2 小鼠极易感染SARS-CoV，且肺部能检测到很高的病毒载量，感染后第4 天，小鼠体重显著降低并开始死亡［11］，死亡主要是由于病毒扩散到大脑造成的［13］。另一项研究中，研究者构建了mACE2 启动子控制下表达hACE2 的转基因小鼠，也出现了类似的感染相关症状［14］。

1.1.1K18-hACE2 小鼠模型 随着SARS-CoV-2 ／ACE2 相互作用的发现［1］，K18-hACE2 小鼠模型再次被应用于研究COVID-19 的致病机理、筛选临床药物与疫苗研发中。第1 个成功构建的SARS-CoV-2转基因小鼠感染模型是在mACE2 启动子的控制下表达hACE2［14-15］。在14 d 的监测期内，感染SARSCoV-2 的小鼠体重显著减轻，对感染后第1 天组织中的病毒核酸载量进行检测，除了肺脏中检测到病毒，其他组织或器官中未检测到病毒，表明感染几乎完全发生在肺部。感染后1 ～5 d，肺部均检测出很高的病毒载量，肺部病理结果显示，感染后第3 天开始，出现中度间质性肺炎、淋巴细胞渗入、黏液积累和支气管细胞脱粒等［15］。

最近一项研究结果显示，K18-hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2 后第5 天，体重降低10% ～15%，至第7 天，体重下降至感染前的75%［16］。感染后第2 天，肺部可检测到高病毒载量，同时在心脏、大脑、肾脏和脾脏也检测到一定的病毒载量。感染后第7 天，肺功能显著下降，具体表现为吸气能力减弱、组织阻力和弹性增加。感染后肺组织RNA 测序结果表明，其先天免疫功能上调，特别是核因子-kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）依赖性、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素（interferon，IFN）信号通路及白细胞活化通路。同时许多研究表明［17-19］，K18-hACE2 小鼠感染SARSCoV-2 后的第5 天存在感染剂量依赖性致死，表明SARS-CoV-2 与SARS-CoV 一样对这些转基因小鼠有致死性。

1.1.2HFH4-hACE2 小鼠模型 研究表明，大多数感染的HFH4-hACE2 小鼠在感染后的7 d 内体重出现减轻，从感染后第4 天开始体重明显降低的小鼠越来越虚弱，感染后第6 天，外周血淋巴细胞和中性粒细胞大量增加，这与人类一些严重疾病的表现相似［20-21］。肺组织病理结果显示，感染后第1 天，有巨噬细胞和淋巴细胞渗透，感染后第7 天，逐渐演变为严重肺炎、阻塞末期支气管炎、大面积的肺纤维化和肺泡坏死［15］。HFH4-hACE2 感染小鼠的肺部、眼睛、大脑和心脏中均可检测到病毒，表明该病毒在肺部感染后可能扩散到其他组织部位［15，22］。SARSCoV-2 再次感染康复后的HFH4-hACE2 小鼠，小鼠体重变化不明显，且病毒载量降低、存活率提高，表明初次感染后，小鼠的相关免疫系统被激活。

1.2腺病毒转导系统 腺病毒载体（adenovirus vector，AdV）系统可将人类受体插入小鼠基因组，对于制备基因缺失或转基因小鼠很有价值。复制缺失腺病毒载体已用于将人二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DDP4）插入野生型小鼠基因组中，使其易于感染中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）［23］。感染的小鼠表现出肺炎症状，在第6 天肺部出现免疫细胞渗透，且病毒被清除［20］。

同样，BALB ／ c 小鼠体内转导含有hACE2 的腺病毒（AdV-hACE2），转导10 h 后，其肺部可稳定表达hACE2［19］。AdV-hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2后8 d 内，体重减轻10%，肺部检测到很高的病毒载量，心脏、大脑、肝脏和脾脏中也检测到一定的病毒载量，血管周围和肺泡部位出现大量中性粒细胞积聚，组织学检查可见血管充血。相较于感染SARSCoV-2 的AdV-hACE2 小鼠，给予可暂时抑制Ⅰ型IFN 信号通路的单克隆抗体—抗IFNAR1 抗体，可导致小鼠体重下降20%以上，且伴随更严重的肺部炎症。给予中和抗SARS-CoV-2 刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S 蛋白）（1B07）抗体，可降低小鼠疾病的严重程度，在这类感染实验中，小鼠体重减轻程度较少。感染后第4 天，肺部、心脏和脾脏中病毒载量降低，感染后第6 天，促炎细胞因子、趋化因子［白细胞介素-6（interleukin -6，IL-6）、C-X-C 基序趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）、C-X-C 基序趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、C-C 基序趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、C-C 基序趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）］在肺部表达降低，免疫细胞在肺部浸润减少。

1.3CRISPR 系统 利用CRISPR ／ Cas9 开发了一种表达人源化hACE2 小鼠模型，通过嵌入与红色荧光蛋白TdTomato 相关的hACE2 使mACE2 表达中断［24］。在该系统中，hACE2 在mACE2 启动子的控制下表达，主要表达部位为肺脏和肾脏，且与野生型小鼠类似。人源化hACE2 小鼠感染SARS-CoV-2后，在其大脑、气管和肺部检测出高的病毒载量，幼龄鼠与老龄鼠肺部检测到的病毒载量基本一致。但与感染的幼龄鼠相比，感染的老龄鼠肺内有大量中性粒细胞浸润，且存在肺泡增厚、血管损伤和出血等现象。胃内感染试验可在气管和肺部检测出高病毒载量，表明口服攻毒途径也可导致肺部感染。

1.4小鼠适应性病毒株 病毒可通过连续传代、靶向突变感染野生型小鼠。这种方式降低了研究人员的生物风险，且更类似于小鼠的自然宿主-病原体相互作用。但由于小鼠的适应性导致这种感染方式不能完全展现人类疾病的相关症状，因此，这种感染方式产生的模型使用受限。

这种方法已用于研究SARA-CoV。SARA-CoV 通过连续在幼龄BALB ／ c 小鼠的呼吸道传代，可产生小鼠适应性病毒株SARS-CoV（MA15），小鼠感染该病毒株的第3 天开始陆续死亡［25］。感染后第1 天，在肺部检测到高病毒载量，在大脑、肝脏和脾脏中也检测到了一定的病毒载量，这可能是由于其通过病毒血症进入到肺以外的其他脏器，同时在气道及肺泡中可观察到淋巴细胞、中性粒细胞以及坏死细胞碎片。另一种小鼠适应性病毒株SARS-CoV（v2163）是通过连续感染6 周龄的BALB ／ c 小鼠产生的［26］。这种病毒感染可导致比MA15 更严重的症状，产生更高的死亡率，出现更严重的免疫反应和肺部病变。

有研究表明，小鼠适应性SARS-CoV-2 在连续传播感染后，S 蛋白的受体结合域（receptor binding domain，RBD）发生了突变，可有效感染幼龄和老龄野生型BALB ／ c 小鼠［27］。感染后第7 天，小鼠肺部检测到高的病毒载量，并表现出轻度肺炎，伴有炎症细胞浸润、肺气管损伤、出血和内皮细胞变性。该模型用于评估RBD-Fc 疫苗的效果，产生了中和抗体，从而有效防止了感染。类似的研究也表明，修饰SARS-CoV-2 S 蛋白的RBD 有助于S 蛋白与mACE2有效结合，更利于病毒入侵宿主细胞［28］。感染这种病毒后，与幼龄鼠相比，老龄鼠的体重减轻和肺功能下降较明显，与人类患病表型具有相似性。

不同SARS-CoV-2 易感转基因小鼠模型见表1。

表1 SARS-CoV-2 易感转基因小鼠模型的比较Tab.1 Comparison of SARS-CoV-2 susceptible transgenic mouse models

2 叙利亚仓鼠（Syrian hamster）模型

几十年来，叙利亚仓鼠一直应用于由呼吸道病毒（如SARS、腺病毒和流感病毒）引起的感染研究。与SARS-CoV-2 S 蛋白受体结合域相互作用的hACE2序列与叙利亚仓鼠的ACE2 序列通过生物信息学软件比对显示，在结合界面上仅有3 ~ 4 个突变，具有较高的相似度［28］。此外，前期的动物研究表明，同样使用ACE2 受体进入细胞的SARS-CoV 也可在叙利亚仓鼠中稳定复制［28］。表明叙利亚仓鼠也可作为研究SARS-CoV-2 感染的实验动物模型。

叙利亚仓鼠通过滴鼻感染病毒后，表现出轻度至中度疾病症状，体重在感染后1 ～2 d 开始逐渐减轻。感染不同SARS-CoV-2 毒株的叙利亚仓鼠均显示出呼吸困难的症状［29-30］，部分还表现出了一些其他症状，如嗜睡、毛皮竖起和弓背姿势［31］，感染2 周后，叙利亚仓鼠通常会恢复健康。叙利亚仓鼠与人类感染SARS-CoV-2 后临床表现相似，其中老龄鼠和雄性鼠比年轻和雌性鼠更易出现严重的疾病症状［30］。感染SARS-CoV-2 后，可在叙利亚仓鼠呼吸道和其他组织（如小肠）中检测到病毒RNA，这有助于评估治疗药物和疫苗对疾病的防治效果。同时，研究人员还观察到病毒向同笼叙利亚仓鼠的传播［31］，表明叙利亚仓鼠也可用于研究疾病的传播。通过病理组织检测，感染SARS-CoV-2 后第2 天开始可在叙利亚仓鼠的上、下呼吸道中检测到大量病毒抗原和细胞凋亡的炎症浸润，感染后第4 天最严重，炎症在感染后第14 天消退。在非呼吸道组织中，只有肠道检测出病毒抗原表达，疾病导致了严重的上皮细胞坏死、肠绒毛受损和变形。

BOUDEWIJNS 等［32］发现，在叙利亚仓鼠中观察到的SARS-CoV-2 诱导的肺部病变似乎是由宿主免疫反应引起的。多项研究表明，先天免疫系统失调会导致感染SARS-CoV-2 后出现严重的临床症状，先天免疫系统过度活跃导致的细胞因子风暴，被认为是感染SARS-CoV-2 后出现严重症状的病理驱动因素。此外，由于适应性免疫功能障碍导致的T 细胞免疫抑制可能会增加SARS-CoV-2 全身传播的可能性［31］。对仓鼠的免疫学研究表明，Ⅰ型IFN 反应，尤其是STAT 2 信号通路是SARS-CoV-2 发病机制的关键。一项针对Stat1-／-叙利亚仓鼠的研究表明，STAT2 信号促进了SARS-CoV-2 引起的肺部严重损伤，但抑制了病毒的全身传播［29］。一项针对Rag1-／-叙利亚仓鼠的研究表明，在SARS-CoV-2 感染后的早期，功能性B 和／ 或T 细胞的缺失会加剧发病［27］。相关研究表明，感染SARS-CoV-2 的叙利亚仓鼠可产生强烈的体液免疫反应，并在14 d 内产生有效的中和抗体（neutralizing antibodies，NAbs），可保护其免受再次感染［31，34］。此外，注射恢复期叙利亚仓鼠血清对未感染叙利亚仓鼠起到了保护作用，并降低了感染SARS-CoV-2 叙利亚仓鼠肺和鼻甲组织中的病毒载量［31］。

尽管在感染SARS-CoV-2 的叙利亚仓鼠模型中观察到与人类感染SARS-CoV-2 后相似的病理现象和免疫反应，但叙利亚仓鼠并不会死于SARS-CoV-2感染，这与人类临床特征不符。最近研究人员发现，另一种仓鼠模型——罗博罗夫斯基侏儒仓鼠（Phodopus roborovskii）对SARS-CoV-2 高度敏感［35］。这种仓鼠模型疾病发作更迅速，临床症状更严重，与人类感染SARS-CoV-2 过程中观察到的严重临床和病理症状更加相似。但除了需人道安乐死（体重减少15%以上）的仓鼠外，在roborovskii 侏儒仓鼠中也未出现死亡现象。

3 应用及面临的挑战

通过转基因、腺病毒、CRISPR 等系统进行修饰的小鼠或感染了小鼠适应病毒的野生型小鼠是研究中应用最为广泛的，因为造模简单、成本低，同时还具有类似人类肺部炎症、组织病理学病变等典型特征。与小鼠相比，可用于叙利亚仓鼠的研究试剂有限，如缺少用于检查宿主免疫反应的免疫试剂，特别是缺少用于蛋白质表达的免疫试剂。尽管存在这些限制，叙利亚仓鼠仍凭借其具有与人类相同的病毒发病机制和免疫反应，及能够传播病毒的特点，成为目前研究中一种重要的SARS-CoV-2 动物模型。

感染动物模型的预防与治疗措施在临床试验中的可行性取决于其物种特征。有研究表明，抑制病毒RNA 依赖性RNA 聚合酶的药物-Remdesivir（GS-5734）在SARS-CoV 和MERS-CoV 感染小鼠模型中具有疗效［36］；一种重组人源单克隆抗体在感染SARSCoV-2 的hACE2 小鼠模型中显示出较好的治疗与预防效果［37］；而另一种中和抗体在感染SARS-CoV-2 的金黄地鼠模型中具有较好的效果［38］。同时，这些动物模型在药代与药物剂量方面提供了相关数据，使相关药物转换至人体研究成为可行［36］。

SARS-CoV-2 感染动物模型对研发具有保护性作用的疫苗十分重要。感染动物模型是筛选潜在药物的一种快速方法。在小鼠模型中，已验证不同的蛋白、RNA 和病毒性疫苗可产生抗SARS-CoV-2 抗体，同时，这些抗体在体外也可防止人源细胞感染SARS-CoV-2［39］。同样的，S 蛋白相关的纳米药物可在小鼠中诱导产生抗体及激活CD4、CD8 T 细胞来抵抗SARS-CoV-2［40］。目前已有130 多种疫苗处于研发中，动物模型对于在其中筛选适用于人体的疫苗十分重要。

目前的COVID-19 疫苗通过诱导机体产生靶向SARS-CoV-2 刺突蛋白的中和抗体，从而起到一定的保护作用。但由于新毒株的出现（如起源于英国的B.1.1.7、巴西的P.1、南非的B.1.351、印度株B.1.617.1）及其刺突蛋白的变异产生的变异株，现有疫苗的有效性可能会受到影响。动物模型的发展至关重要，有助于深入了解其发病机制，以及加快候选疫苗和治疗药物的研发，对于阻止新的变异毒株流行蔓延起到关键作用。