一种经济高效的酵母菌落PCR模板DNA 制备方法的建立

刘微，戴凌燕，苗青，彭辉，张东杰，李志江，3

1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319；3.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319

酵母作为最简单的真核生物，因代谢途径特殊， 遗传操作方法简单等优势而被广泛应用于生理生化功能的研究［1］。同时，酵母也是人类实践中应用较早的一类微生物。早在1978 年，就建立了酵母菌遗传转化技术［2］。以酵母作为模式生物，人们对真核生物的认知取得了巨大进展［3-4］。许多研究是以敲除内源基因或表达外源基因的方式对酵母进行遗传改造，为了获取酵母基因组中的目的基因片段或筛选酵母转化后的阳性转化子，通常需提取基因组作为PCR 模板［5］。但酵母基因组提取耗时长，通常根据酵母的生长周期（100 ~ 300 min），需要1 ~ 3 d 的时间以积累足够的菌体；提取过程一般为2 ~ 6 h，操作复杂，试剂用量大，而且使用的氯仿、苯酚等试剂如操作不当，会对身体健康造成一定危害。

菌落PCR 是一种无需提取基因组，直接使用单菌落菌体进行基因型鉴定与分析的方法，可用于基因扩增［6-7］、菌株鉴定［8-9］、阳性转化子筛选［10-11］等多种分子生物学领域，操作简便、快捷，无需进行菌体积累，生长至肉眼可见的单菌落即可作为实验材料，极大地缩短了培养时间。但不同于普通细菌的细胞结构，酵母细胞壁中多糖占比达85% ~ 90%，其次是10% ~ 15%的蛋白质。而通过0-糖苷键相连的甘露聚糖和蛋白质中的苏氨酸或丝氨酸则构成甘露糖蛋白，覆盖于细胞表层，使得酵母细胞具有良好的韧性［12-13］。因此，若直接使用普通的细菌菌落PCR 方法扩增目的基因或鉴定酵母阳性转化子，通常因破壁效果差，基因组无法释放而不能得到理想结果，成功率低［14］。目前常用的酵母破壁方法有酶解法、高温法、冻融法、超声波法、液氮研磨法、商品试剂盒等，酶解法DNA 损伤小，但操作繁琐，酶试剂价格高且不易存储；高温法操作简便，设备要求低，但易造成基因组DNA 降解；冻融法DNA损伤小，但操作繁琐，耗时长，设备要求高；超声波法破壁效果较好，但菌体积累时间长，实验效果不稳定；液氮研磨法成本低，效果好，但耗时、费力，不适于大规模操作；商品试剂盒效果良好，但耗时长，成本高。

为改进酵母菌落PCR 效果，通常要在进行PCR反应之前对酵母细胞进行预先的破壁处理。但目前常用的破壁方法效果均不理想，从实验效果和实验成本上来说，并不适用于大规模的阳性转化子筛选。酵母菌落PCR 仍存在适用性窄，成功率低的问题。为解决这一难题，本研究对以往文献报道过的酵母菌落PCR 技术进行了改进，建立了一种经济高效的酵母菌落PCR 模板DNA 制备方法，以期提高工作效率，降低实验成本。

1 材料与方法

1.1菌株及载体 鲁氏酵母菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号：CICC 32899）；磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TPI，EC：5.3.1.1）基因过表达载体TPI-pECS-URA（MCS1）由转导精进（武汉）生物技术有限公司构建。

1.2主要试剂及仪器 2 × Taq PCR Master Mix 购自北京天根生化科技有限公司；乙酸乙酯、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）、氯仿、异丙醇、Tris、EDTA、浓盐酸、无水乙醇等均为国产分析纯试剂；电击转化仪购自美国BTX 公司（ECM830 型）；PCR 扩增仪（T100 型）和凝胶成像系统（Gel Doc XR+型）购自美国Bio-Rad 公司。

1.3引物设计及合成 通过NCBI 数据库的Nucleotide（www.ncbi.nlm.nih.gov）获得鲁氏酵母菌目的基因序列，利用Primer 5.0 软件设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 基因克隆及阳性转化子筛选所用引物序列Tab.1 Primer sequences for gene cloning and positive transformant screening

1.4菌株培养与重组菌株构建 在无菌条件下将鲁氏酵母菌接种于YPD 琼脂平板，28 ℃，培养2 ~3 d，直至长出直径0.5 mm 左右的菌落，用于菌落PCR。挑取菌体，接入无菌液体YPD 培养基中，28 ℃，180 r ／ min 条件下培养24 h，积累菌体，用于基因组DNA 提取后进行PCR。

将载体TPI-pECS-URA（MCS1）通过电击转入鲁氏酵母感受态细胞中构建重组菌株，涂布于YPD 平板，28 ℃培养至长出肉眼可见的直径0.5 mm 左右的菌落，备用。

1.5酵母基因组DNA 提取 将单菌落接入无菌液体YPD 培养基，培养24 h 后，15 294 ×g 离心1 min，收集菌体，于液氮中充分研磨至白色、均匀细粉状，向离心管中加入不超过100 mg 菌体和600 μL DNA 提取液［1 mol ／ L Tris·HCl（pH = 8.0）10.0 mL，5 mol ／ L NaCl 2.5 mL，0.5 mol ／ L EDTA（pH = 8.0）2.5 mL，10% SDS 2.5 mL，去离子水32.5 mL］，60 ℃水浴30 min；4 ℃，15 294 × g 离心5 min，移取上清液，加入等体积氯仿，混匀并静置10 min；4 ℃，15 294 × g 离心5 min，再次移取上清液至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀后在-20 ℃下静置30 min；4 ℃，15 294 × g 离心5 min，弃上清液，向离心管中加入1 mL 70%乙醇，摇动清洗，再次离心5 min，弃上清液，于超净台风干后，向离心管中加入100 μL 无菌水，60 ℃水浴溶解，摇匀即得基因组DNA，-20 ℃保存。

1.6乙酸乙酯-高温破壁法制备模板 向1.5 mL 离心管中加入乙酸乙酯100 μL，挑取酵母单菌落适量菌体（肉眼可见即可，避免菌体过量或带入培养基影响试验结果）加入离心管中，充分搅拌，涡旋振荡5 min 后，于90 ～100 ℃水浴加热至乙酸乙酯全部蒸发，得到提取物；向离心管中加入50 μL 无菌水，涡旋振荡5 min 后，于90 ～100 ℃水浴加热5 min，得到酵母单菌落DNA，作为处理组模板，4 ℃保存备用。

1.7高温破壁法制备模板 向1.5 mL 离心管中加入无菌水50 μL，挑取酵母单菌落适量菌体加入离心管中，充分搅拌，于90 ～100 ℃水浴加热5 min，得到酵母单菌落DNA，-20 ℃保存。

1.8PCR 反应 反应体系：2 × PCR Mix 20 μL，上下游引物各2 μL，基因组DNA 模板3 μL，加入超纯水至终体积为50 μL。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳液为1×TAE，每个加样孔点样5 μL，恒压100 V，电泳45 min 后，使用凝胶成像仪记录结果。

2 结 果

2.1目的基因的扩增 随机选择10 个菌落，分别以菌液提取的基因组DNA、菌落通过高温破壁法以及乙酸乙酯-高温破壁法制备的DNA 为模板，利用3对基因引物进行PCR 扩增，结果显示，引物1488 和1248 在以菌落制备DNA 和菌液基因组DNA 为模板的PCR 结果相同，均扩增出特异性目的基因条带，且条带清晰、明亮，无明显拖尾或弥散现象（图1A、B、D、E）。引物944 仅3 号菌的菌落PCR 未扩增出目的基因条带，其他菌落均与菌液PCR 结果一致（图1G、H）。而以高温破壁法制备的DNA 为模板进行目的基因扩增时，仅2 号、7 号菌落扩增出特异性目的基因条带，且条带亮度较低（图1C、F、I）。

2.2阳性转化子筛选 随机挑选TPI 基因过表达鲁氏酵母重组菌的10 个单克隆，利用引物754 进行菌落制备DNA 和菌液基因组DNA 为模板的PCR 扩增，结果显示，采用乙酸乙酯-高温法制备模板进行菌落PCR 时，2、5、8 号转化子有明显特异性扩增条带；以菌液基因组DNA 为模板再次对相应转化子进行PCR 鉴定，结果显示，2、5、6、8 号转化子有明显特异性扩增条带。同时，另选取10 个经验证为阳性的转化子，以高温破壁法制备DNA 为模板再次进行PCR 验证，仅5 号菌落扩增出特异性目的基因条带。见图2。

图2 酵母阳性克隆的筛选Fig.2 Screening of positive clones of yeast

A：引物1448 的菌落PCR；B：引物1448 的基因组DNA PCR；C：引物1448 的高温破壁菌落PCR；D：引物1248 的菌落PCR；E：引物1248 的基因组DNA PCR；F：引物1248 的高温破壁菌落PCR；G：引物944 的菌落PCR；H：引物944 的基因组DNA PCR；I：引物944 的高温破壁菌落PCR；M：DNA marker DL2000；1：空白对照（以去离子水为模板）；2 ～11：10 个随机挑选的菌落。

3 讨 论

乙酸乙酯作为常见的萃取溶剂，具有溶解细胞壁的功能；涡旋振荡及水浴也会使细胞壁出现不同程度的破损；以上方法结合使用，既能使酵母细胞充分破碎，释放其基因组DNA，又不会因加热时间过长，引起基因组DNA 的降解。

本研究对常规酵母菌落PCR 模板制备方法进行了改进，将乙酸乙酯法与高温法相结合。直接挑取单菌落菌体加入乙酸乙酯中，充分涡旋振荡后，将乙酸乙酯彻底蒸发，加入无菌水后再次涡旋振荡并加热，即可得到菌落基因组DNA，可直接作为菌落PCR 模板。此方法的优势在于，首先，效率高，在基因克隆中可达96.7%（29 ／ 30），阳性克隆筛选中可达90%；其次，耗时短，操作简单，成本低，制取1 个单菌落的PCR 模板所需时长仅为20 min 左右，所需试剂与耗材仅为100 μL 乙酸乙酯（约0.01 元），1.5 mL 离心管1 个（约0.04 元），制取1 个单菌落的PCR 模板总价不超过0.1 元，具有极大的成本优势。此外，与各种机械破壁法相比，所用仪器均为实验室常规仪器，易于操作。相比于传统的高温破壁法［15］，或叶玲等［16］采取的酵母菌落水溶液直接PCR 法，本实验提供的方法结果更加稳定。胡荣飞等［17］利用研磨仪对菌体进行破壁处理，效果良好。但相比于乙酸乙酯-高温法，所需仪器、试剂种类较多，操作复杂。与唐巧玲［18］等报道的利用SDS 和醋酸锂进行破壁，并提取酵母基因组的方法相比，本实验建立的方法更加高效便捷，易于操作。

综上所述，与现有的菌落PCR 模板制备方法相比，本实验为酵母基因组中目的基因克隆和大规模的酵母转化子筛选及鉴定提供了快速、经济有效的新方法，可解决基因组提取费时费力及大规模筛选转化子高价试剂用量大的问题。