鸟苷酸结合蛋白2 对人脐带来源间充质干细胞成骨分化的调控作用

白海涛，刘伟江，袁福临，李雪，王洋，刘元林，王振山，张毅

1.河北大学生命科学院，河北 保定 071002；

2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种来源于中胚层的具有多项分化潜能和自我更新能力的成体干细胞。MSC 来源十分广泛，可从脐带、骨髓、脂肪、胎盘等多种组织分离获得［1］，在不同培养条件下可向脂肪、成骨、成软骨等细胞分化［2］。MSC是脂肪细胞和成骨细胞的共同祖细胞，可调控成脂分化和成骨分化的平衡，维持骨稳态［3-4］。MSC 来源的前成骨细胞表达成骨细胞的早期标志物Ⅰ型胶原和碱性磷酸（alkaline phosphatase，ALP），而终末分化的成骨细胞表达骨钙素（osteocalcin，OCN）并显示出形成矿化细胞外基质的能力。在成骨细胞分化早期，成骨关键转录因子Runx2 促进MSC 向成骨细胞分化和相关基因表达［5］，BMP2 也在MSC 中发挥重要作用［6］，同时抑制MSC 向脂肪细胞谱系的分化。PPARγ［7］和C／EBP-α［8］是共同调控脂肪细胞的重要基因，并驱动脂肪细胞分化进程。Runx2 促进MSC 成骨分化的同时还可抑制成脂分化［9］，同时成脂分化关键转录因子PPAR-γ 也可抑制成骨分化［7］。研究表明，MSC 增殖分化的改变（成脂分化增加、成骨分化减少）是导致骨质疏松的主要原因之一［10-11］。因此，揭示MSC 向成骨细胞分化的分子机制将有助于进一步了解MSC，并为骨质疏松症的治疗提供新的方法。

鸟苷酸结合蛋白2（guanylate binding protein 2，GBP2）是γ 干扰素（interferon γ，IFNγ）诱导的GBP家族的一员，其编码的蛋白是一种GTP 酶，可将GTP水解成GDP。GBP2 主要存在于高尔基体膜上，也可作为分泌蛋白被分泌至胞外区域。研究发现，GBP2在细胞固有免疫中发挥重要作用［12］，可调控树突状细胞（dendritic cell，DC）的成熟，抑制T 细胞增殖［13］。此外，GBP2 与细胞焦亡相关，GBP2 缺失的巨噬细胞诱导细胞焦亡能力消失，且不能分泌IL-1β 和IL-19［14］。本实验前期研究发现，GBP2 在脐带MSC 中高表达，但是否参与调控MSC 生物学特性尚不清楚。因此，本实验通过构建过表达GBP2的慢病毒载体，并感染人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，hUC-MSC），检测过表达GBP2的hUC-MSC 的成骨分化能力，探讨GBP2是否参与MSC 的成骨诱导分化作用。

1 材料与方法

1.1细胞及载体 hUC-MSC 为军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所冻存细胞；GBP2 过表达慢病毒载体由上海吉凯基因科技有限公司合成。

1.2主要试剂及仪器 α-MEM、0.25%胰酶、PBS、胎牛血清、Trizol 购自美国Invitrogen 公司；油红O、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、胰岛素、β-磷酸甘油、维生素C 磷酸盐、丙酮酸和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）购自美国Sigma 公司；10%中性甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；RTase M-MLV、RNA 酶抑制剂及5 × RTase M-MLV 缓冲液购自日本TaKaRa 公司；DTT、dNTP、无RNA 酶水和2×Μltra Master Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司；感染增强液A（HiTransA）、P（HiTransP）由上海吉凯基因科技有限公司合成；流式抗体（鼠抗人CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45 单抗）、嘌呤霉素（Puromycin）、荧光定量PCR 仪、q-PCR 仪购自美国Thermo Fisher 公司。

1.3hUC-MSC 的培养及鉴定 从液氮中取1 支P2代hUC-MSC，置37 ℃快速解冻，用含10% FBS 的α-MEM 重悬，200 ×g离心，弃上清，用α-MEM 完全培养基重悬并接种至T75 细胞培养瓶，置37 ℃，5%CO2恒温培养箱培养；用0.25%胰酶消化MSC，取部分细胞接种至6 cm 细胞培养皿，37 ℃恒温培养箱培养至70% ～80%融合度后，弃上清，70%乙醇固定15 min；PBS 洗涤2 次，加入1 × 吉姆萨染色液染色30 min；PBS 洗涤2 次，加入1 mL PBS，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。部分细胞避光孵育流式抗体（APC-CD14、APC-CD34、APC-CD45、PE-CD73、PECD90、PE-CD105），检测hUC-MSC 表面抗原表达；另一部分细胞进行成脂、成骨诱导分化。成脂分化诱导体系：地塞米松1×10-6mol／L，IBMX 5×10-4mol／L，胰岛素1 × 10-5ng ／ L，吲哚美辛5 × 10-4mol ／ L；成骨诱导分化体系为：地塞米松1 × 10-7mol ／ L，β-磷酸甘油1 × 10-2mol ／ L，维生素C 磷酸盐5 × 10-5mol ／ L。成脂及成骨分化细胞均每隔2 d 进行换液，培养2 周左右，成脂分化细胞进行油红O 染色，实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，q-PCR）法检测成脂分化关键转录因子PPAR-γ、ADI表达；成骨分化细胞进行ALP 染色，q-PCR 法检测成骨关键转录因子OPN、ALP表达。

1.4GBP2过表达慢病毒载体转染hUC-MSC 将生长状态良好的hUC-MSC 按1 × 105个／ 孔接种至6 孔板，第2 天待细胞贴壁状态良好后换液，将细胞分为3 组进行转染，每组3 个复孔，分别为慢病毒（MOI = 10）+ P 感染增强液／ A 感染增强液／ 未添加感染增强液组，设未转染的hUC-MSC 组，37 ℃培养12 h；加入1 mL 完全培养基，24 h 后更换完全培养基；转染第3 天换液，加入嘌呤霉素（Puromycin）（1 μg ／ mL）筛选转染细胞，待细胞长满6 孔板，传代至T75 培养瓶继续培养。荧光显微镜下观察转染效率即GFP 荧光表达，流式细胞术和q-PCR 法检测转染细胞中GBP2的表达。GBP2-shRNA 序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系为：cDNA 1 μL，PCR 引物（10 μmol ／ L）1 μL，q-PCR Master Mix 10 μL，去离子水8 μL。反应条件为：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 个循环；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。

表1 过表达慢病毒GBP2-shRNA 序列Tab.1 Sequence of lentiviral vector for overexpression of GBP2-shRNA

1.5相关基因表达的检测 采用q-PCR 法。Trizol法提取各组MSC 总mRNA，1 μg 体系定量逆转录成cDNA，以其为模板，q-PCR 法检测相关基因表达。q-PCR 引物序列见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系及反应条件同1.4 项。以GAPDH为内参基因，采用2-△△Ct表示待测基因mRNA 表达水平。

表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers

1.6统计学分析 流式细胞术结果使用flowjo-10 软件进行分析；q-PCR 结果使用7500software v2.0.6软件处理，并采用GraphPad 7.0 软件分析作图。所有试验重复3 次，采用t检验分析，结果以均数± 标准差表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1hUC-MSC 的鉴定 体外培养的hUC-MSC 形态呈长梭形，贴壁生长，见图1。流式细胞术检测hUC-MSC 细胞表型，结果显示，细胞高表达CD73、CD90、CD105（＞95%），低表达CD14、CD34、CD45（＜2%），见图2。对hUC-MSC 进行成脂诱导分化，油红O 染色结果显示，诱导组脂滴数明显高于自分化组，且成脂分化关键转录因子PPAR-γ 和ADI的表达较自分化组也显著增加（t分别为32.63 和20.37，P均＜0.001），见图3。对hUC-MSC 进行成骨诱导分化，ALP 染色结果显示，诱导组ALP 活性增加，成骨分化关键转录因子OPN、ALP表达也显著增加（t分别为50.04 和21.65，P均＜0.001），见图4。表明培养的hUC-MSC 符合国际MSC 判定标准。

图1 体外培养hUC-MSC 的形态学鉴定Fig.1 Morphological identification of hUC-MSCs cultured in vitro

图2 hUC-MSC 表面标志物的流式细胞术检测Fig.2 Flow cytometry of surface markers of hUC-MSCs

图3 hUC-MSC 成脂（油红O 染色）和成骨诱导分化（ALP染色）能力鉴定Fig.3 Identification of induced adipogenic（oil red O staining）and osteogenic（ALP staining）differentiations of hUC-MSCs

图4 q-PCR 法检测hUC-MSC 成脂和成骨分化关键转录因子的表达Fig.4 Determination of expressions of adipogenic and osteogenic differentiations-related transcription factors in hUC-MSCs by q-PCR

2.2过表达GBP2慢病毒载体转染hUC-MSC 的GFP 的表达 A 感染增强液感染的hUC-MSC GFP阳性细胞数明显高于P 感染增强液组，见图5。流式细胞术检测结果显示，A 感染增强液感染的hUCMSC GFP 荧光阳性率显著高于P 感染增强液组，见图6，表明A 感染增强液感染强度显著高于P 感染增强液。q-PCR 结果显示，与hUC-MSC 组比较，未添加感染增强液组及A、P 感染增强液组感染的hUC-MSC 中均高表达GBP2（t分别为3.511、4.33和5.047，P分别为0.024 7、0.0123 和0.007 2），而A 感染增强液组hUC-MSCGBP2表达显著高于P 感染增强液组（t= 5.075，P＜0.01），见图7。表明已成功获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC 细胞，即GBP2highhUC-MSC。

图5 荧光显微镜下观察GFP 阳性细胞Fig.5 Fluorescent microscopy of GFP positive cells

图6 流式细胞术检测慢病毒感染效率Fig.6 Flow cytometry of transfection efficacy of lentivirus

图7 转染效率（A）和GBP2 基因mRNA 相对表达水平（B）Fig.7 Determination of transfection efficiency（A）and GBP2 mRNA level（B）

2.3过表达GBP2对MSC 生物学特性的影响GBP2highhUC-MSC 的细胞形态与正常MSC 一致，均呈长梭形贴壁生长，见图8。流式细胞术检测结果显示，GBP2highhUC-MSC 高表达CD73、CD90、CD105（＞95%），低表达CD14、CD34、CD45（＜2%），见图9。体外诱导分化结果显示，GBP2highhUC-MSC 可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞，油红O 染色后出现红色脂滴，且成脂关键转录因子ADI、PPAR-γ 高表达（t分别为7.603 和11.92，P分别为0.001 6 和0.000 3）；ALP 染色后出现蓝色，且成骨分化关键转录因子ALP、OPN高表达（t分别为6.939 和3.213，P分别0.002 3和0.032 5）。见图10 和图11。表明过表达GBP2未改变hUC-MSC 的生物学特性。

图8 P4 代GBP2highhUC-MSC 细胞形态观察Fig.8 Morphology of GBP2highhUC-MSC of P4

图9 流式细胞术检测GBP2highhUC-MSC 的细胞表型Fig.9 Flow cytometry of phenotype of GBP2highhUC-MSC

图10 GBP2highhUC-MSC 成脂（油红O 染色）、成骨诱导分化（ALP 染色）的观察Fig.10 Induced adipogenic（oil red O staining）and osteogenic（ALP staining）differentiations of GBP2highhUC-MSC

图11 q-PCR 法检测GBP2highhUC-MSC 成脂和成骨关键转录因子的表达Fig.11 Determination of adipogenic and osteogenic differentiations-related transcription factors in GBP2highhUC-MSC by q-PCR

2.4过表达GBP2对MSC 成骨诱导分化的促进作用 hUC-MSC 和GBP2highhUC-MSC 的成骨诱导分化结果显示，GBP2highhUC-MSC 组ALP 活性明显高于hUC-MSC 组，见图12。表明GBP2highhUC-MSC 的ALP 活性明显增强，GBP2可促进MSC 成骨分化。进一步的q-PCR 结果显示，与hUC-MSC 组比较，成骨诱导分化后GBP2highhUC-MSC 中ALP和OPN的表达显著提高（t分别为3.555 和5.694，P分别为0.023 7 和0.004 7），表明GBP2可促进MSC 的成骨分化。

图12 ALP 染色法检测GBP2highhUC-MSC 的成骨分化能力Fig.12 Determination of osteogenic differentiation ability of GBP2highhUC-MSC by ALP staining

3 讨 论

骨质疏松症是一种以骨含量低、骨组织微结构化为特征的全身性骨病［15-16］，随着许多国家的人口老龄化，骨质疏松症已成为一个重大的健康问题。有证据表明，年龄相关性骨质疏松症的发展与骨形成减少和骨髓脂肪积累增加有关［17］。

MSC 是一种成体干细胞，具有多向分化潜能，可向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞分化。研究表明，MSC 是脂肪细胞和成骨细胞的共同祖细胞，可通过调控成脂和成骨分化的平衡，维持骨稳态。MSC 的成脂和成骨分化能力失衡，向脂肪细胞分化增多，成骨细胞分化减少是导致骨质疏松的部分原因。因此，研究MSC 成骨分化的分子机制对骨质疏松等相关疾病的治疗具有重要意义。

近年来随着研究的不断深入，发现IFNγ 可通过上调Runx2、ALP、OCN 的表达促进成骨细胞的形成［18］，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）作为Runx2 下游靶基因发挥成骨分化能力。IFNγ-／-小鼠来源的MSC中Runx2 表达较低，成骨分化能力也因此降低。此外，各种免疫细胞包括B 细胞、促炎M1 型巨噬细胞、树突状细胞和NK 细胞等通过产生IFNγ 抑制破骨细胞的形成［19-21］。本实验室前期研究发现，GBP2是INFγ 诱导的GBP 家族成员，IFNγ 处理MSC 后，其GBP2 高表达，因此我们拟就GBP2 能否调控MSC的多向分化能力展开相关研究。

本实验首先设计并构建了稳定过表达GBP2的慢病毒载体，有研究显示，MSC 代数会影响MSC 的成骨分化能力［22］，因此，将慢病毒载体转染P4 代前的hUC-MSC，获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC（GBP2highhUC-MSC）。进一步对慢病毒感染后的MSC的生物学特性进行鉴定，结果表明，GBP2highhUC-MSC保持MSC 的成纤维样细胞形态，高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD14、CD34、CD45。体外诱导分化结果显示，GBP2highhUC-MSC 可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞，油红O 染色后出现红色脂滴且高表达成脂关键转录因子ADI、PPAR-γ，ALP 染色结果阳性且高表达成骨分化关键转录因子ALP、OPN。上述结果表明，过表达GBP2未改变hUC-MSC 的生物学特性。但对GBP2highhUC-MSC 进行成骨诱导分化时发现，其成骨分化能力相较于正常hUC-MSC 显著提高，ALP 活性较hUC-MSC 组显著增强，成骨分化相关转录因子ALP、OPN的表达也显著提高。上述结果表明，GBP2过表达可明显促进hUC-MSC 的成骨分化，GBP2 参与调控MSC 成骨分化，具体机制有待进一步探讨。综上所述，GBP2 可有效促进hUCMSC 的成骨分化，对进一步探讨MSC 的成骨细胞分化以及骨质疏松治疗提供了实验依据。