茯苓-泽泻药对对高脂血症痰浊证ApoE-/-小鼠肝、肾组织中水通道蛋白的作用研究❋

周小文，王雅欣，闫振乾，任 琦，方 格，李先涛△

(1.广州中医药大学基础医学院，广州 510006；2.湖南中医药大学中医学院，长沙 410208)

高脂血症是人体血脂代谢失常所致的一种常见的代谢性疾病，起病隐匿，易诱发冠心病、中风、糖尿病、肾衰竭等病变[1]。已有研究表明，当脂肪细胞内脂肪过多并超过其储备能力时，多余的脂质将会分流到肝细胞、肾细胞、胰岛细胞等非脂肪组织内，刺激机体发生炎症反应[2]。中医认为过食肥甘厚味人体膏脂蓄积阻碍脾胃运化，则津液失于输布，痰浊内生，脏腑功能失常[3]。多数医家认同高脂血症病变涉及肝、脾、肾三脏，痰浊阻遏为该病主要证候[4]。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是介导水跨细胞膜转运的膜转运蛋白，对机体的水液转运具有调控作用[5]。国内多名学者提到AQPs的生理功能与中医“津液代谢”活动具有相似性，对AQPs的调控可能与中医“祛湿”“化湿”“利水”等作用有关[6]。《景岳全书》认为茯苓为“治痰之本，助降之药”，《本草正》提到泽泻“其功长于渗水去湿，故能行痰饮”，二药配伍则倍增健脾化痰、利水祛湿之效。现代药理研究已证实，茯苓、泽泻单味药中均含有三萜类、倍半萜类、多糖类等活性成分，具有降脂、降糖、保肝、利尿、抗氧化等作用[7]。基于以上理论，本研究通过建立高脂血症痰浊证ApoE-/-小鼠模型，拟从肝脏AQP8、AQP9和肾脏AQP2功能角度探讨茯苓-泽泻药对治疗高脂血症痰浊证的内在机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级C57BL/6j ApoE-/-雄性小鼠60只，6周龄，体质量18～22 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物合格证号SCXK(苏)2016-0010。小鼠饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中，温度20 ℃～24 ℃，相对湿度40 %～60%，光照和黑暗12 h交替进行。普通饲料由广州中医药大学实验动物中心提供，高脂饲料由广东省动物医学实验动物中心提供(加工配方：基础饲料52.2%，蔗糖20%，猪油15%，酪蛋白10%，胆固醇1.2%，磷酸氢钙0.6%，石粉0.4%，预混料0.4%，胆酸钠0.2%)。

1.2 药物及制备

中药饮片茯苓(批号C190301)、泽泻(批号C190701)，购自广州至信中药饮片有限公司；阿托伐他汀钙片(国药准字H20051408，20 mg/片)，辉瑞制药有限公司；茯苓-泽泻水提物：称取茯苓15 g和泽泻10 g置于10倍量的蒸馏水中浸泡20 min, 随后煎煮30 min滤出汤液，余渣再用5倍量蒸馏水煎煮20 min，将2次滤液合并用纱布过滤，将药液浓缩至含生药量0.325 g/mL。阿托伐他汀钙片溶液：将阿托伐他汀钙片溶于蒸馏水中配置成0.26 mg/mL的溶液。

1.3 主要试剂与仪器

总胆固醇(total cholesterol, TC)试剂盒(货号A111-1-1)、甘油三酯(triglyceride, TG)试剂盒(货号A110-1-1)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)试剂盒(货号A113-1-1)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)试剂盒(货号A112-1-1)，南京建成生物工程研究所；一氧化氮(nitric oxide, NO)检测试剂盒(货号KGT00750)，凯基生物公司；AQP2抗体(货号A16209)，ABclonal 公司；生产即用型免疫组化EliVision plus试剂盒(编号KIT-9902)，迈新试剂生物公司；逆转录试剂盒(货号2641A)、实时荧光定量PCR试剂盒(货号RR820A),日本Takara公司；多功能酶标仪(型号Enspire 2300), 美国Perkin Elmer公司；石蜡切片机(型号RM2015), 德国徕卡公司；实时荧光定量PCR仪(型号CFX96)，美国Bio-Rad公司。

1.4 模型复制与评价

参考前期研究方法对C57BL/6j 背景ApoE-/-小鼠进行高脂血症痰浊证病证结合模型复制[8]。适应性喂养1周后，将60只ApoE-/-小鼠按照体质量随机分为正常组10例和模型组50例。正常组饲喂普通饲料，模型组饲喂高脂饲料，造模时长为4周。造模结束后，采血检测血脂4项，并结合一般情况判断模型建立情况。

高脂血症痰浊证病证结合模型的判断标准依据前期研究[9]：血脂水平异常；体胖、倦怠；饮食量或饮水量减少。高脂血症实验动物模型评价依据国家食品药品监督管理局颁布的《辅助降低血脂功能评价方法》[10]，模型对照组和空白对照组比较，血清TG升高，血清TC或LDL-C升高，差异有统计学意义，判定混合型高脂模型成立。该评价方法对应高脂血症痰浊证病证结合模型评价标准中的血脂水平异常。

1.5 分组及给药方法

模型建立成功后，正常组保持原分组，根据血清TC值将50只模型小鼠随机分为模型组、西药组(阿托伐他汀溶液，2.6 mg/kg)、茯苓-泽泻低剂量组(茯泽低，1.625 g/kg)、茯苓-泽泻中剂量组(茯泽中，3.25 g/kg)、茯苓-泽泻高剂量组(茯泽高，6.50 g/kg)5组各10只，各组TC值基线水平比较差异无统计学意义。每只小鼠每日灌胃量为0.1 mL/10 g，正常组和模型组给予同等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，给药7周。

1.6 样本采集

给药结束后所有小鼠禁食12 h，称量体质量并测量体长(鼻到肛门的距离)，以备Lee’s指数[11]计算。计算公式为Lee’s 指数=[体质量(g)×1000/体长(cm)]^(1/3)。如1只体质量为30 g、体长为10 cm的小鼠，其Lee’s 指数=[30 g×1000/10 cm]^(1/3)=14.4225。腹腔注射3.5%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉60只小鼠，眼眶取血。离心后分离血清，-80 ℃待测血脂4项。分离小鼠肝脏分装至EP管内冻存备测。分离双侧肾脏组织，洗涤后分装至4%中性甲醛溶液常温固定备用，以及冻存管留取部分-80 ℃保存。

1.7 指标检测

1.7.1 一般情况观察 给药7周后观察各组小鼠的精神状态、饮水量和饮食量变化，统计分析给药后的体质量和Lee’s指数。

1.7.2 生化法检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和肾组织NO水平 按照试剂盒说明书使用酶标法测定各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。分离肾组织的肾皮质进行匀浆处理，离心后取上清，硝酸还原酶法测定NO的含量。

1.7.3 荧光定量PCR检测肝组织AQP8、AQP9和肾组织AQP2、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)mRNA 表达 Trizol提取各组小鼠肝肾组织样品总RNA并测量浓度和纯度，使用试剂盒将RNA反转录成cDNA。表1示，对反转录产物进行PCR扩增反应，以β-actin为内参。PCR扩增反应体系为：5 μL稀释5倍的cDNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、10 μL Taq DNA聚合酶预混液，4 μL双蒸水。PCR扩增反应条件为：变性95 ℃、5 min，退火95 ℃、10 s，延伸60 ℃、34 s，39个循环，最终数据以2-△△Ct进行计算。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.7.4 免疫组化检测肾组织AQP2表达 石蜡包埋肾脏组织并切片，将其进行脱蜡、脱水及消除内源性过氧化物酶处理。将切片置于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(PH 6.0)中加热，冷却后PBS洗净。滴加5% BSA，室温孵育后先后经AQP2抗体(浓度1∶500)、KIT-9902试剂A(反应增强液)和KIT-9902试剂B(酶标抗小鼠/兔IgG聚合物)孵育。经显色、复染、水洗等操作后封片。采用Image Pro Plus 6.0软件分析图像的平均光密度(mean optical density, MOD)。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 模型建立与评价结果

造模前所有小鼠状态良好，对外界刺激反应灵敏，自主活动频率较高。造模后，模型组小鼠出现精神倦怠、嗜睡、自主活动频率降低。造模前后2组小鼠体质量差值，正常组10只(2.91±1.68)g，模型组50只(3.77±1.11)g，2组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示高脂饮食对ApoE-/-小鼠体质量有显著影响。造模期间，模型组小鼠在22 d以前饮水量较正常组多，22 d后出现下降趋势；而在饮食量变化上，模型组小鼠在22 d后饮食量多于正常组且呈上升趋势(图1)。考虑模型组小鼠因长期食用高脂饲料出现渴不欲饮的症状。

图1 2组小鼠造模期平均饮水、饮食量变化趋势

表2示，造模4周末的血脂4项结果显示，与正常组比较，模型组TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)，结果符合混合型高脂血症实验动物模型标准。综合一般情况，提示高脂血症痰浊证病证结合ApoE-/-小鼠模型建立成功。

表2 造模后小鼠血脂4项检测结果比较

2.2 给药后各组小鼠一般情况

给药7周后，茯苓-泽泻各剂量组和西药组小鼠精神状态优于模型组小鼠，其反应更为灵敏，嗜睡倦怠程度减轻。但在饮食、饮水量方面未发现各组间有明显差异(图2)。表3示，与正常组比较，模型组体质量与Lee’s指数有上升趋势，但差异无统计学意义；与模型组比较，茯泽高组Lee’s指数显著降低(P<0.01)。

图2 给药期各组小鼠平均饮水、饮食量变化趋势

表3 给药后各组小鼠体质量和Lee’s指数比较

2.3 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和肾皮质NO水平比较

表4示，给药结束后与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C和肾皮质NO水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，茯泽低组小鼠血清LDL-C水平降低(P<0.05)；茯泽中组和西药组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平均降低(P<0.05，P<0.01)；茯泽高组小鼠血清TC水平显著降低(P<0.01)，肾皮质NO含量有下降趋势。

表4 给药后各组小鼠血脂4项与肾皮质NO检测结果比较

2.4 各组小鼠肝组织AQP8、AQP9和肾组织AQP2、iNOS mRNA 表达比较

表5示，与正常组比较，模型组肝脏AQP8和AQP9 mRNA表达显著下调(P<0.01)，肾组织AQP2和iNOS mRNA表达显著上调(P<0.01)；与模型组比较，茯泽高组肝脏AQP8、AQP9 mRNA表达显著上调(P<0.05)，各剂量组和西药组肾组织AQP2、iNOS mRNA显著下调(P<0.01)；与西药组比较，茯泽低组肝组织AQP8 mRNA上调(P<0.05)，肾组织iNOS mRNA显著下调(P<0.01)。

表5 各组小鼠肝组织AQP8、AQP9 和肾组织AQP2、iNOS mRNA表达比较

2.5 各组小鼠肾组织AQP2免疫组化结果

图3示，与正常组比较，模型组小鼠AQP2密集分布在肾脏外髓质集合管内壁细胞上，MOD值显著升高(P<0.01)；与模型组比较，茯苓-泽泻各剂量组与西药组小鼠肾脏AQP2的MOD值显著降低(P<0.01)。

注：1.正常组；2.模型组；3.西药组；4.茯泽低；5.茯泽中；6.茯泽高；与正常组比较：** P<0.01; 与模型组比较：##P<0.01；MOD(mean optical density)为平均光密度；水通道蛋白2(aquaporin 2，AQP2)

3 讨论

《医学心悟》中提到：“凡人嗜食肥甘，或醇酒奶酪，内湿从内受湿生痰。”饮食不节致体内膏脂蓄积，阻碍脾胃运化则津液输布障碍酿生痰浊，由此可见痰浊与高脂血症关系密切。有学者认为，痰浊证是高脂血症的主要证候[12]。孙建芝等[13]提出，血清中TC、TG和LDL-C的增高可作为痰浊证微观辨证指标的一部分。本研究发现，模型组ApoE-/-小鼠饲喂高脂饮食4周后，表现为倦怠嗜睡、饮水量减少以及血清TC、TG和LDL-C水平升高，可知该方法所造高脂血症模型与痰浊证的表现相符[9]。AQPs是一族介导自由水跨细胞膜转运的膜转运蛋白，它们广泛存在于各类组织细胞中，参与机体吸收、分泌、排泄等生理活动，其表达水平可以密切反映机体水液代谢的生理与病理状态[14]。持续喂养高脂饮食7周后，模型组小鼠肝组织和肾组织中AQPs均出现异常表达。可见，一方面痰浊是津液输布障碍的病理产物，另一方面痰浊长期滞于血脉中影响津液代谢，对全身脏腑的功能亦产生影响。在本研究中，茯苓-泽泻对小鼠的lee’s指数、血脂水平、肝组织AQP8、AQP9和肾组织AQP2、iNOS的表达所起到的调控作用，能够部分揭示调节水液代谢以改善痰浊证的生物学机制。

AQP8在肝脏中主要分布于细胞内和小管质膜内，介导肝脏中水的转运以及胆汁的分泌[15]。有研究表明，AQP8受固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs)调控，通过对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)的调节，参与肝细胞内胆固醇的合成过程[16]。在高胆固醇负载的Huh-7细胞中，线粒体AQP8的水平显著下调，且伴随着活性氧的大量增加[17]。AQP9分布在肝细胞窦面，是一种特异性的水-甘油通道蛋白，负责肝脏与血液中甘油等物质的转运，参与肝脏的脂代谢和糖代谢[18]。在禁食状态下，脂肪分解诱导AQP9的表达增加，由此促进甘油从外周组织流向肝细胞，用于后续的糖异生过程；而在进食状态下，丰富的营养物质诱导脂肪生成，甘油以TG的形式储存在脂肪细胞中，肝脏AQP9的表达降低[19]。本研究结果显示，高脂饲料喂养的模型小鼠肝脏AQP8和AQP9 mRNA表达显著降低。推测在高脂血症状态下，胆固醇在肝细胞内高度负载，使得肝脏发生氧化应激反应，诱导活性氧的大量生成，AQP8受SREBPs的调控而下调；同时，长期摄食高脂高胆固醇食物诱导脂肪细胞中TG大量合成，脂解过程受到抑制则肝脏AQP9的表达下调。经过茯苓-泽泻药对治疗后，模型小鼠的血脂降低，肝脏AQP8和AQP9 mRNA表达上调，提示茯苓-泽泻可以缓解小鼠的肝脏损伤，改善肝脏内水和甘油的转运，促进脂质的进一步代谢。

AQP2主要表达于肾髓质集合管主细胞管腔侧和靠近管腔侧的囊泡内，受抗利尿激素精氨酸加压素的调节，参与水的滤过和重吸收过程[20]。此外，AQP2在管腔膜上的转运、基因转录与表达还受NO的调控[21]。NO作为一种内源性舒张因子，在肾脏中发挥着调控体液转运和调节微循环的作用。研究表明，iNOS及NO过度表达伴随肾小球损伤的加重，使用iNOS的抑制剂可以减轻肾脏损伤[22]。本研究结果显示，模型组小鼠肾脏NO含量、AQP2和iNOS表达与正常组比较均显著升高，提示高脂饮食会导致肾脏出现氧化应激反应造成肾损伤，肾脏的重吸收作用遭到破坏。经茯苓-泽泻治疗后，AQP2在肾脏外髓质集合管内壁细胞上表达显著减少，iNOS mRNA表达下调，NO含量出现下降趋势，提示茯苓-泽泻可以缓解肾脏损伤，恢复肾脏正常的重吸收功能。

《医宗必读》曰：“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，瘀而成痰”，可见高脂血症的主要病机为“脾虚失运、痰浊内生”。因此，治疗此病应重视健脾化痰。茯苓-泽泻这一药对为李先涛临床常用降脂经验方化痰降浊方的君药，在前期拆方研究中发现其具有良好的降脂效果[11]。茯苓利水渗湿兼以健脾；泽泻利水渗湿，化浊降脂；两药合用补泄并施，既可健脾益气又可利水泄浊，有助于津液的输布。本研究从肝脏和肾脏AQPs的角度部分阐释茯苓-泽泻干预高脂血症痰浊证的内在机制可能与该药对通过健脾助运、调节水液代谢、抑制痰浊生成和促进痰浊排泄有关。但是该药对治疗高脂血症的效果尚未达到剂量-效应关系，需要在今后的研究中进一步优化剂量配伍，实现疗效的最大化。