石仙桃总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究

林继辉,谢冰冰,冯庆玲,戴玉梅

(闽南科技学院 生命科学与化学学院, 福建 南安 362332 )

石仙桃(PholidotachinensisLindl )，石兰科石仙桃属植物[1]；我国西南、华南和台湾地区均有分布[2]，为药食两用食材[3]，药理活性优越市场需求量大，相关的鉴定研究较少[4]、易与石斛等混淆[5].石仙桃的主要成分有萜类、多糖、酚类、黄酮、香豆素等，其中总黄酮以环石仙桃萜醇、环石仙桃萜酮为主，具有治疗高热、头晕[6]、咳血[7]、增强免疫力[8]等作用.据国内外研究表明石仙桃具有生物活性[9]、抗氧化活性、抗癌性[10]，从中提取的部分新化合物对人结肠癌细胞株具有良好的抗增殖能力[11].由此可见，石仙桃提取物的开发研究对人类生命健康安全具有积极作用.

黄酮类化合物在蔬菜、水果、中草药的根、茎、叶中均有分布，是植物新陈代谢的一级代谢产物[12].绝大多数黄酮类物质可以通过清除自由基而具有抗氧化性，而部分黄酮类物质因其不同结构而产生一定的抑制癌细胞增殖作用[13].因此研究石仙桃总黄酮的提取有利于天然药物化学的研究，为天然抗氧化物质的开发具有积极的意义.

目前国内主要的石仙桃总黄酮提取工艺主要有闪式提取法[14]、乙醇回流提取法[15]、超声波辅助提取法[16]、微波辅助提取法[17]等.其中闪式提取法在提取时间为 3 min，80%的乙醇体积分数、液料比 35 mL/g 的条件下，其平均提取率为1.52%；乙醇回流提取法在液料比 30 mL/g、65%的乙醇体积分数、温度 66 ℃ 的条件下提取 151 min，得到的平均提取率为1.23%；微波辅助提取法在液料比为 21 mL/g、60%的乙醇体积分数、功率为 800 W 的条件下置于微波中 63 s，得到的平均提取率为1.52%；超声波辅助提取法在乙醇体积分数为66%、液料比为 26 mL/g、温度为 61 ℃ 的条件下超声 41 min，得到平均提取率为1.76%.

实验采用超声波辅助提取石仙桃总黄酮，在传统4因素3水平的基础上增加粒径因素，在单因素实验的基础上，采用响应面优化提取工艺.在最优工艺条件下得到的平均提取率为1.80%，相对于乙醇回流提取法相比，在时间和效率上有了明显提高；相较微波法和闪式法时间偏长，但提取率明显优于二者；超声波法相对于文献差异不显著，证明了实验结果具有一定的可靠性，能够为石仙桃总黄酮提取工艺的进一步研究提供粒径的数据参考.在最优工艺下提取总黄酮，并对粗提物，以抗坏血酸威阳性对照进行抗氧化性能测试，得出石仙桃总黄酮对DPPH自由基具有良好的清除作用，并且粗产品具有一定的稳定性，有利于进一步的纯化加工.实验弥补了文献粒径筛选数据上的空白，验证实验方法，为进一步的研究提供理论依据.

1 实验设计

1.1 主要材料、药品及仪器

石仙桃(购于广西百色)；芦丁标准品(UV≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司)、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸铁、水杨酸(以上均为分析纯，配成不同浓度使用)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、30%过氧化氢溶液、L(+)-抗坏血酸(UV≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司)；

KQ-400E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、EL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、RE-2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、V-1100D型分光光度计(MAPADA)、DGX-9053B型鼓风干燥箱(上海南荣实验室设备有限公司)、600Y型多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、FD-1冷冻干燥机(上海丞明设备有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理

将 5 000.0 g 石仙桃洗净，切块自然晾干，于 60 ℃ 烘箱内干燥至恒重，得到 404.5 g 干石仙桃假鳞茎，按照药材粉碎最适含水量小于5%计算，得出新鲜石仙桃假鳞茎含水量大致为92%.将干石仙桃假鳞茎放入粉碎机粉碎，过不同粒径筛分(0.850、0.425、0.250、0.180、0.150 mm)并分装入广口试剂中密封保存备用.

1.2.2 提取方法

称取 0.180 mm 石仙桃粉末 1.00 g 于 100 mL 锥形瓶中，加入一定体积的乙醇水溶液于不同提取温度的超声波清洗器中超声一段时间，提取结束后，将粗提液抽滤，并将滤液在 55 ℃ 的条件下用旋转蒸发仪减压浓缩.

1.2.3 检测原理及方法

采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定总黄酮的含量.基于亚硝酸钠能将黄酮类物质还原，并与铝盐形成螯和，加入氢氧化钠使其开环生成2-羟基查耳酮，呈现出橙红色[18].该反应发生在黄酮醇类成分中邻位无取代的邻二酚羟基部位，因此不具备此基团的脂肪、多糖、蛋白质等无此显色反应.采用芦丁作为标准品，在 510 nm 处测定吸光度.

将1.2.2中获得的浓缩液移入 50 mL 具塞比色管中，定容至刻度.取 2 mL 于 10 mL 具塞比色管中，添加 0.6 mL 5%亚硝酸钠，震荡静置 6 min.加入 0.6 mL 10%的硝酸铝，震荡静置 6 min.最后加入 3.0 mL 4%氢氧化钠溶液，定容至刻度，震荡静置 15 min，测定吸光度，后代入芦丁标准曲线方程(Y=6.684 5X-0.003 3，R2=0.999 5)计算得出总黄酮的质量浓度ρ，并按式子(1)计算石仙桃总黄酮提取率，实验结果平行测定3次并取平均值[14,19].

(1)

式中：50为待测体积(mL)；10为显色体积(mL)；2为检测体积(mL)；ρ为总黄酮质量浓度(mg/mL)；m为样品质量(g).

1.2.4 单因素实验

1) 乙醇体积分数的影响 称取 0.180 mm 石仙桃粉 1.00 g 于 100 mL 锥形瓶中，在液料比 25 mL/g、提取温度 60 ℃ 的条件下超声 40 min，考查不同体积分数乙醇溶液(55%、60%、65%、70%、75%)对石仙桃总黄酮提取率的影响，以确定最优乙醇体积分数.

2) 液料比的影响 称取 0.180 mm 石仙桃粉 1.00 g 于 100 mL 锥形瓶中，在乙醇体积分数65%、提取温度 60 ℃ 的条件下超声 40 min，考查不同液料比(15、20、25、30和 35 mL/g)对石仙桃总黄酮提取率的影响，以确定最优液料比.

3) 温度的影响 称取 0.180 mm 石仙桃粉 1.00 g 于 100 mL 锥形瓶中，在乙醇体积分数65%、超声 40 min、液料比 25 mL/g 的条件下，考查不同提取温度(40、50、60、70和 80 ℃)对石仙桃总黄酮提取率的影响，以确定最优提取温度.

4) 提取时间的影响 称取 0.180 mm 目石仙桃粉 1.00 g 于 100 mL 锥形瓶中，在乙醇体积分数65%、液料比 25 mL/g 的条件下，超声温度 60 ℃、液料比 25 mL/g 的条件下，考查不同超声时间(20、30、40、50和 60 min)对石仙桃总黄酮提取率的影响，以确定最优提取时间.

5) 粒径大小的影响 称取 1.00 g 石仙桃粉末于 100 mL 锥形瓶中，在乙醇体积分数65%、液料比 25 mL/g、提取温度 60 ℃、超声时间 40 min 的条件下，考查不同粒径(0.850、0.425、0.250、0.180和 0.150 mm)对石仙桃总黄酮提取率的影响，以确定最优提取时间.

1.2.5 响应面设计

利用Design-Expert 8.05b软件，在单因素实验基础上，以总黄酮提取率为响应值.设计乙醇体积分数,%(A)、液料比,mL/g(B)、超声温度,℃(C)、超声时间，min(D)、粒径,mm(E)5因素3水平共46次实验以获得最优提取工艺条件；因素与水平设计见表1.

表1 响应面设计编码表

1.2.6 抗氧化研究

1) DPPH自由基清除能力 取一定量的石仙桃粉末，按1.2.2的提取方法减压浓缩后于冷冻干燥器中冷冻至干，得到总黄酮粗提物.分别取总黄酮粗提物 20 mg，配成ρ为 2 mg/mL 的溶液.分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于 10 mL 具塞比色管中，稀释至刻度，得到分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样品待测液；采用相同方法配制相同浓度的阳性对照VC浓液.

取不同浓度样品液 2 mL 于 10 mL 具塞比色管内，加入 2 mL 0.04 g/L 的DPPH，混合均匀，避光 30 min，于 517 nm 处测吸光度，记为Ai；另取样液 2 mL 于试管中，加 2 mL 无水乙醇，避光 30 min，在 517 nm 处测吸光度，记为Aj；取 2 mL 0.04 g/L 的DPPH和 2 mL 无水乙醇于 10 mL 具塞比色管中，于 517 nm 处测其吸光度，作为参照，记为A0.抗坏血酸(VC)为阳性对照，DPPH自由基清除率的计算如公式(2)[20-22].

(2)

2) 羟基自由基清除能力 按(1)方法配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的待测液.依次加入 0.3 mL 6 mmol/L 的硫酸亚铁和 0.5 mL 6 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液于 10 mL 具塞比色管中.加入 1 mL 待测液及 2 mL 蒸馏水.最后用 0.3 mL 6 mmol/L 过氧化氢启动.于 37 ℃ 下水浴 30 min，在 510 nm 处测定吸光度，记为AX；以蒸馏水代替样品液记为A0；不加过氧化氢的测定吸光度并记录为Ax0.以抗坏血酸VC为阳性对照，以空气为校准值，羟基自由基清除率按照公式(3)计算[21].

(3)

1.2.7 数据处理

单因素实验、响应面及验证实验以同一比色管中的溶液平行测定3次，抗氧化性及标准曲线以同一比色皿中的溶液校准后平行测定3次，各实验数据均以平均值和标准误差来表示并用作响应面进行方差分析，采用Excel制图.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数的影响

由图1可知，当乙醇体积分数在55%～65%变化时，石仙桃总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而递增，在65%时达到最高；这主要是由于当乙醇体积分数小于65%时，溶液的极性随乙醇体积分数增加而减弱，能够促进黄酮类物质溶解；但当乙醇体积分数大于65%时，提取率随之递减.而当乙醇的浓度超过65%时，溶剂的极性进一步降低后亲脂性物质的溶解度增加[23]，与黄酮竞争溶出，同时植物细胞内部的蛋白质因发生变性凝固，形成传质阻力不利于黄酮类物质溶出[24]，最终导致提取率有所下降.因此确定最优乙醇体积分数为65%.

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.1.2 液料比的影响

实验结果见图2，由图可知当液料比在15～25 mL/g 时，提取率随液料比的增加而提高；在液料比达到 25 mL/g 时达到最值；当液料比超过 25 mL/g 时，提取率随液料比的增加而降低.这是由于当液料比小于 25 mL/g 时，石仙桃粉末与溶剂的接触不充分，不利于黄酮的溶出，随着溶剂增多，石仙桃粉末中总黄酮的内外浓度差增加，促进了总黄酮的溶出，因而提取率升高，在液料比为 25 mL/g 时达到最值1.8%；当液料比超过 25 mL/g 时，由于物料中提取物含量有限，即使溶剂增加对提取率的改变不大，反而使其它物质溶出对提取率造成影响[24]，导致提取率减小，因此确定液料比 25 mL/g 为最优条件.

2.1.3 提取温度的影响

由图3可知，当超声提取温度小于 60 ℃ 时，石仙桃总黄酮提取率随提取温度上升而增加，在提取温度为 60 ℃ 时达到最值；当超声温度大于 60 ℃ 时，提取率随温度上升反而减小.这是因为，当温度在一定范围内变化时，温度增加促进黄酮类化合物分子的热运动有利于其溶出，在 60 ℃ 时提取率达到最高，而当温度过高时，会加快乙醇溶剂的挥发和其它物质的溶出从而影响其提取率，因而导致提取率降低，因此确定最优超声提取温度 60 ℃.

图2 液料比对总黄酮提取率的影响

图3 温度对总黄酮提取率的影响

2.1.4 时间的影响

实验结果见图4，由图可知当超声时间低于 40 min 时，提取率随超声时间增加而上升，超声时间在 40 min 时达到最高值；这是由于超声时间的增加有利于物料与溶剂的接触，在超声波的协同下有利于内部有效物质的溶出[15,24].而当时间过长，部分黄酮类物质被超声波的空化或热效应破坏，而导致提取率下降，故超声波时间 40 min 为最优条件.

2.1.5 粒径大小的影响

实验结果见图5，由图可知当粒径 0.180 mm 以下时，提取率随粒径的减小而增加，在 0.180 mm 达到最值，粒径小于 0.180 mm 时有所回落.其原因在于，当石仙桃颗粒过大时，石仙桃粉末与溶剂之间的接触面积过小，从而导致接触不充分，随粒径的减小，接触面积增加，促进了黄酮类物质的溶解，粒径在 0.180 mm 时达到顶峰，而筛目过大，导致粉末过细，使黄酮类物质易在空气中氧化，且受到超声波空化及热效应的影响，最终导致提取率降低，因此粒径对石仙桃总黄酮提取率影响的最优条件为 0.180 mm .

图4 超声时间对总黄酮提取率的影响

图5 粒径大小对总黄酮提取率的影响

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计实验结果

在单因素的基础上，以石仙桃总黄酮提取率为响应值，利用Design-Expert 8.05b软件对试验设计的提取工艺参数进行优化，响应面实验结果见表2.

表2 响应面实验结果

续表2

2.2.2 模型建立极显著性分析

利用响应面软件对表2的数据结果进行五元二次回归拟合处理，得到回归模型方程：Y提取率=1.83+0.098A+0.0.094B-0.12C+0.012D-0.065E-0.061AB+0.09AC-0.11AD-0.039AE+0.027BC-0.001BD-0.090BE+0.14CD+0.046CE-0.056DE-0.24A2-0.25B2-0.22C2-0.21D2-0.19E2

表3 方差分析

续表3

由F值和P值可知，各主因素的影响顺序为：温度>乙醇体积分数>液料比>粒径>超声时间.回归方程一次项A、B、C、E极显著(P<0.01)，二次项AC、AD、BE、CD、A2、B2、C2、D2、E2极显著(P<0.01)；AB、DE显著(P<0.05)；一次项D，交互项BD、BC不显著(P>0.05)，说明各因素与提取率之间并非简单的线性关系.

2.2.3 各因素间的交互关系

图6为响应面实验设计中各因素交互关系的响应面图.通过响应面图可以间接的判断各因素间影响的主次关系以及因素间的交互作用强弱[24]；同时还可以从端点高低(坡度)[25]、等高线离心率大小、等高线疏密程度[24]及交互项F值大小判断，而获知各因素的交互作用对总黄酮提取率影响的相对显著性.由图6e，6f的响应面等高线离心率都偏小，图形接近圆，说明液料比对温度、粒径的交互作用不显著，与方差分析的结果相一致；图6b、6e、6h、6i是有关温度与乙醇体积分数、液料比、超声时间、粒径交互作用的响应面图，由图可知沿温度方向比其它几个因素方向坡度更陡，等高线更加密集，说明温度比其它4个因素对总黄酮提取率的影响更显著；同理在图6a、6c、6f响应面中可知沿乙醇体积分数方向比沿液料比、超声时间、粒径坡度更陡，等高线更加密集，说明乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响比液料比、超声时间、粒径更加显著.同理由图6f、6g的响应面图和等高线图可知液料比比超声时间、粒径对总黄酮提取率的影响更加显著.综上可得主次因素顺序为：温度>乙醇体积分数>液料比>粒径>超声时间与表3方差分析表相一致.

图6 各因素交互作用对总黄酮提取率的影响

2.2.4 最佳工艺条件的验证

根据回归方程和实际检验，根据响应面分析得出最佳工艺条件是在60%乙醇、液料比为 25 mL/g、粒径为 0.180 mm、温度 60 ℃ 的条件下超声 40 min.得出响应面模型预测值为1.83%，而实际平均值是1.80%，与预测的相对误差为1.64%，验证模型的有效性以及文献对粒径选择的合理性.

2.3 抗氧化分析

2.3.1 石仙桃总黄酮DPPH自由基清除能力

实验结果如图7所示，结果表明：石仙桃总黄酮和VC对DPPH·的清除率在0.05～0.8 mg/mL 的范围内呈一定的量效应关系.DPPH·清除率随着总黄酮浓度和VC的升高而增加，即二者呈现出正相关；对DPPH·清除的IC50值分别为0.11和 0.052 mg/mL.从抗坏血酸(VC)阳性对照实验可以看出其对DPPH·的清除明显优于相同浓度的石仙桃总黄酮提取物.

2.3.2 石仙桃总黄酮对羟基自由基清除能力

从图8可以看出当石仙桃总黄酮和VC在0.00～0.25 mg/mL 的范围内，对·OH清除率随着总黄酮量和VC的增加而增强.总黄酮和VC对·OH清除的IC50值为0.083和 0.021 mg/mL，说明其具有抗氧化活性.

图7 石仙桃总黄酮和维生素C对DPPH·的清除能力

图8 石仙桃总黄酮和维生素C对·OH清除能力

3 结语

在传统4因素3水平的实验基础上增加粒径作为考查因素，虽响应面未能对工艺进行明显优化，但验证了文献粒径选择的合理性，弥补了对粒径数据上的空白，为进一步研究提供了理论依据；在单因素实验的基础上利用响应面优化法得到最优工艺条件为：乙醇体积分数60%、粒径 0.180 mm、液料比 25 mL/g、温度 60 ℃、超声提取时间 40 min；在此条件下实验得出石仙桃总黄酮提取率为1.8%，该工艺相对于传统的乙醇回流提取法，提取时间上有着明显的提高，并且提取率提高了46.3%.与微波辅助提取法相比，虽然时间上增加了 39 min，但提取率提高了18.42%.经过验证实验与模型的预测值误差为1.64%，误差较小，说明模可靠；抗氧化性实验表明石仙桃总黄酮具有较好的抗氧化性，在一定范围内抗氧能力随浓度的增加而增强，但抗氧化能力低于相等浓度的VC阳性对照，同时实验还未对超声波功率对石仙桃总黄酮提取率的影响进行探究，需在后续实验中加以完善.