响应面法优化茅岩莓茶黄酮的提取条件

王鑫俣，王菲，贾天赐，项冰，杨朝齐，杨磊

响应面法优化茅岩莓茶黄酮的提取条件

王鑫俣，王菲，贾天赐，项冰，杨朝齐，杨磊

（辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001）

为探讨茅岩莓茶中黄酮的最佳提取工艺，以茅岩莓茶为原料，采用单因素和响应面结合的方法，通过乙醇溶液浸提茅岩莓茶黄酮，对其提取条件进行优化。结果表明，最佳提取条件为：乙醇体积分数为80%，液料比为25 mL/g，水浴温度为85 ℃，水浴时间为40 min；此时，黄酮得率为162.72 mg/g，与模型所给预测值接近，说明优化方法合理可行。

茅岩莓茶； 黄酮； 提取； 响应面法

茅岩莓茶又名长寿藤，学名为显齿蛇葡萄，葡萄科，为野生藤本植物[1]，生长于张家界800～1 500 m云雾山的红砂岩中[2]。茅岩莓茶药食两用，不仅对上呼吸道感染、慢性支气管炎、急慢性咽炎的治疗有很好的效果，还能调节血压、平衡血糖、降低血脂、软化血管[3]。研究表明，茅岩莓茶中含有一种天然植物霜，主要成分为黄酮[4]。黄酮类化合物具有杀菌抗炎、抗氧化、抗癌、降脂降压等多种保健效果[5⁃7]。

目前，科技工作者对黄酮类化合的研究越来越重视，因其特有的生物活性和药用价值，研发了多种多样的黄酮类保健品和药物，满足了相关人群的需求。因此，本文以黄酮含量较为丰富、现阶段相关研究报道较少的茅岩莓茶为原料，研究茅岩莓茶黄酮提取的最佳条件，为其今后深入的综合开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

茅岩莓茶，灵周茶叶有限公司；芦丁，色谱纯，合肥博美生物科技有限公司；乙醇（体积分数为95%）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AR124CN电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；All basic分析研磨机，德国IKA公司；DUG⁃9021A电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；SB25⁃12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV⁃2600可见分光光度计，尤尼克（上海）仪器有限公司；HH⁃4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TDL⁃40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1茅岩莓茶黄酮提取 取茅岩莓茶于50 ℃电热恒温干燥箱中烘至恒重，冷却后用粉碎机粉碎，过40目筛，密封保存，备用。称取2.00 g茅岩莓茶粉末，按液料比5～40 mL/g加入体积分数为20%～90%的乙醇溶液，搅拌均匀，在超声功率为0～500 W的条件下处理0～9 min，取出，在水浴温度为20～90 ℃保温10～120 min后，离心取上清液，得到茅岩莓茶黄酮粗提液。

1.3.2黄酮得率的测定 测定黄酮得率采用NaNO2⁃Al(NO3)3⁃NaOH法[8⁃9]。以芦丁质量（）为横坐标，510 nm处的吸光度（）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线数据见表1。回归方程为=0.263 8+0.003，2=0.999 2，黄酮得率计算公式如下：

表1　标准曲线数据

1.3.3响应面实验设计 从单因素实验结果的分析中，选择各因素的水平范围进行响应面实验，从而得到茅岩莓茶黄酮的最适提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1超声处理的影响 在乙醇体积分数为70%、液料比为15 mL/g、水浴温度为50 ℃、水浴时间为20 min和超声时间为5 min的条件下，分别考察超声功率和超声时间对茅岩莓茶黄酮得率的影响，结果见图1和图2。当考察超声功率时，超声时间为5 min；当考察超声时间时，超声功率为50 W。

图1　超声功率对茅岩莓茶黄酮得率的影响

图2　超声时间对茅岩莓茶黄酮得率的影响

从图1和图2可以看出，超声处理对茅岩莓茶黄酮得率的影响较小。这是因为茅岩莓茶细胞壁组织软，经粉碎后被破坏，无需进行超声处理即可实现较好的黄酮提取效果。

2.1.2乙醇体积分数的影响 在液料比为15 mL/g、水浴温度为60 ℃和水浴时间为20 min的条件下，考察乙醇体积分数对茅岩莓茶黄酮得率的影响，结果见图3。

图3　乙醇体积分数对茅岩莓茶黄酮得率的影响

从图3可以看出，当乙醇体积分数为80%时，提取效果最好。分析其可能的原因是：不同乙醇体积分数具有不同的极性，对目标物的溶解性有差异[10]。因此，响应面实验设计乙醇体积分数的三个水平分别选择70%、80%和90%。

2.1.3液料比的影响 在乙醇体积分数为60%、水浴温度为60 ℃和水浴时间为20 min的条件下，考察液料比对茅岩莓茶黄酮得率的影响，结果见图4。从图4可以看出，随着液料比的增加，黄酮得率先增加后趋于平稳；液料比过高，不仅增加成本，而且导致黄酮浓度过低，需要延长浓缩时间，给生产带来负担。因此，响应面实验设计液料比的三个水平分别选择15、20、25 mL/g。

图4　液料比对茅岩莓茶黄酮得率的影响

2.1.4水浴温度的影响 在乙醇体积分数为60%、液料比为15 g/mL和水浴时间为20 min的条件下，考察水浴温度对茅岩莓茶黄酮得率的影响，结果见图5。

图5　水浴温度对茅岩莓茶黄酮得率的影响

从图5可以看出，当水浴温度为20～80 ℃时，随着水浴温度增加，黄酮得率增加，这是因为水浴温度升高，加快了黄酮的扩散速度，提高了其溶解度[11]；当水浴温度为80 ℃时，黄酮得率达到最大值，继续升高水浴温度，黄酮得率下降。因此，响应面实验设计水浴温度的三个水平分别选择70、80、90 ℃。

2.1.5水浴时间的影响 在乙醇体积分数为60%、液料比为15 g/mL和水浴温度为60 ℃的条件下，考察水浴时间对茅岩莓茶黄酮得率的影响，结果见图6。

图6　水浴时间对茅岩莓茶黄酮得率的影响

从图6可以看出，当水浴时间为10～30 min时，随着水浴时间的增加，黄酮得率增加；当水浴时间为30 min时，黄酮得率达到最大值，继续增加水浴时间，黄酮得率下降。这主要是因为长时间的加热处理导致乙醇溶液挥发，溶剂浓度减小，极性发生改变，从而导致黄酮得率降低[12]。因此，响应面实验设计水浴时间的三个水平分别选择10、30、50 min。

2.2 基于响应面法的茅岩莓茶总黄酮提取条件优化

2.2.1响应面实验设计 根据单因素实验结果，选择水浴温度、水浴时间、液料比和乙醇体积分数为自变量，黄酮得率为因变量（响应值），进行4因素3水平的Box⁃Behnken实验。实验因素与水平见表2，实验设计及结果见表3，实验回归模型方差分析结果见表4。

表2　Box⁃Behnken实验因素与水平

表3　Box⁃Behnken实验设计及结果

表4　Box⁃Behnken实验回归模型方差分析结果

注：**代表极显著；*代表显著。

该模型2=0.798 2，变异系数较小（=5.28%），说明模型误差小，实验稳定、可靠，拟合度良好。由表4可知，模型值0.000 1，表明该模型极显著，其统计学上是有意义的。值能够表示各因素在实验中对提取效果的作用程度，值越小，其作用就越大，由此可推断4个因素的作用影响排序为：>>>，即液料比>水浴时间>乙醇体积分数>水浴温度。其中，液料比的影响显著，交互项的影响显著。由Design⁃Expert 8.02软件得出茅岩莓茶黄酮得率（）与各影响因素的回归方程为：

=149.97-0.09+2.78+13.54+0.65+7.77+0.97+0.40+2.28-3.53+0.46-4.602-7.892-2.632-4.152（2）

2.2.2响应面图解析 3D响应面是在其他两个因素一定的条件下，另外两个因素对茅岩莓茶黄酮得率的影响，响应面坡面越陡峭，则响应面受实验因素影响越大，相反则越小。图7为乙醇体积分数、液料比、水浴温度和水浴时间两两相互作用对黄酮得率影响的响应面图。从图7可以看出，图7（a）的响应面陡峭程度最大，表明水浴温度与水浴时间的交互作用对茅岩莓茶黄酮得率的影响最大。

（a）水浴时间和水浴温度 （b）水浴温度和液料比 （c）水浴温度和乙醇体积分数 （d）水浴时间和液料比 （e）水浴时间和乙醇体积分数 （f）乙醇体积分数和液料比

2.2.3验证实验 由响应面软件给出的最佳提取条件为：乙醇体积分数78.79%、液料比25.00 mL/g、水浴温度86.58 ℃、水浴时间43.43 min；在此条件下，茅岩莓茶黄酮得率预测值为162.79 mg/g。为了方便生产操作，将上述条件取整为：乙醇体积分数80%、液料比25 mL/g、水浴温度85 ℃、水浴时间40 min。为了验证该模型的可靠性，在优化条件下进行3次重复实验，茅岩莓茶黄酮得率实际值为162.72 mg/g，与预测值接近，表明此响应面优化法得到的优化条件是准确可行的。

3 结 论

（1）以茅岩莓茶为原料，采用溶剂浸提法提取茅岩莓茶黄酮，经单因素结合响应面优化实验后得到其最佳提取条件为：乙醇体积分数为80%，液料比为25 mL/g，水浴温度为85 ℃，水浴时间为40 min。此时，黄酮得率为162.72 mg/g，与模型所给预测值接近，表明优化方法合理可行。

（2）该方法操作简便且黄酮得率较高，为提取茅岩莓茶黄酮提供了科学的理论基础，也为茅岩莓茶的综合开发利用提供了有效的参考依据。

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Extraction Conditions of Flavonoids from Maoyanberry Tea Using Response Surface Methodology

Wang Xinyu， Wang Fei， Jia Tianci， Xiang Bing， Yang Zhaoqi， Yang Lei

（School of Petrochemical Engineering， Liaoning Petrochemical University， Fushun Liaoning 113001， China）

In order to explore the best extraction technology of flavonoids from Maoyanberry tea, the extraction conditions of flavonoids from Maoyanberry tea were optimized by using the method of single factor and response surface. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: Ethanol volume fraction 80%, liquid⁃solid ratio 25 mL/g, water bath temperature 85 ℃, water bath time 40 min. Under these conditions, the yield of flavonoids was 162.72 mg/g, which was close to the predicted value of the model, indicating that the optimized method was reasonable and feasible.

Maoyanberry tea； Flavonoids； Extraction； Response surface methodology

TQ028.3

A

10.3969/j.issn.1672⁃6952.2022.03.005

1672⁃6952（2022）03⁃0025⁃05

http：//journal.lnpu.edu.cn

2021⁃02⁃27

2021⁃04⁃29

辽宁省教育厅一般科研项目（L2020015）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（2020101480005）。

王鑫俣（2000⁃），女，本科生，生物工程专业，从事生物化工研究；E⁃mail:3025198434@qq.com。

王菲（1982⁃），女，博士，讲师，从事生物化工、食品生物技术研究；E⁃mail:107806708@qq.com。

（编辑 宋官龙）