响应曲面法联合遗传算法优化天然低共熔溶剂提取肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的工

董佳妮 赵龙山 薄彧坤 杨丹 杨雪苗 谭谊萌 安明 邬国栋

关键词天然低共熔溶剂;肉苁蓉;苯乙醇苷类成分;响应曲面法;遗传算法;抗氧化活性;提取效率

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥带鳞叶的肉质，主产于内蒙古、新疆、宁夏和甘肃等地区，素有“沙漠人参”之美誉[1]。研究表明，苯乙醇苷类成分是肉苁蓉的主要功能性成分，且其含量最高，具有抗氧化、抗病毒、保护神经和保肝等作用[2]。其中，松果菊苷是文献记载的首个，也是植物界具有代表性的苯乙醇苷类成分，同时其也是肉苁蓉中主要的指标性成分[3]。支雅婧等[4]从化学成分特有性、可测性、传统功效和药性等方面进行预测，指出毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和松果菊苷可作为肉苁蓉的质量标志物。

目前，针对肉苁蓉中苯乙醇苷类成分提取的研究大多采用50%甲醇为溶剂，具有毒性大、易挥发、易造成环境污染及提取效率低等缺点[5-6]。Abbott 等[7]于2003 年首次发现一种可替代传统溶剂和离子液体的新型绿色低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs），其具有低蒸汽压、低成本、良好的生物降解性和生物相容性等优点。随着研究的深入，Choi 等[8]又发现了DESs 的类似物——天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvents，NADESs）。与DESs 相比，NADESs 的组成成分均为天然化合物或生物体初级代谢产物，因此，其经济性和环境保护作用均优于DESs，已作为一种绿色可调节的提取介质应用于药物活性成分的提取中[9]。

响应曲面法（response surface methodology，RSM）是一种优化工艺条件的有效方法，被广泛用于多因素的实验优化。箱式组合设计（Box-Behnken Design，BBD）是RSM中最常用的实验设计方案，具有实验次数少、简单和经济的优点[10]。遗传算法（genetic algorithm，GA）具有全局寻优的特点，能取得较好的优化和预测效果，在生物活性物质提取方面具有很大潜力[11]。鉴于此，本研究拟采用RSM结合GA优化NADESs 提取肉苁蓉中苯乙醇苷类成分（松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷）的工艺，以期为肉苁蓉的绿色提取和高值化利用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有Thermo U3000 型高效液相色谱仪、Multiskan GO 型酶标仪（美国Thermo FisherScientific 公司），BSA224S-CW型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），KQ-500E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

肉苁蓉药材（批号190802003）购自内蒙古聚诚中药饮片有限公司，由包头医学院药学院安明教授鉴定为肉苁蓉C. deserticola Y.C.Ma 的干燥带鳞叶的肉质。将其干燥，粉碎（过四号筛），备用。

松果菊苷对照品（批号AF20051710，纯度98%）、毛蕊花糖苷对照品（批号AF20110904，纯度98%）、异毛蕊花糖苷对照品（批号AF20051701，纯度98%）均购自成都埃法生物技术有限公司;1，3- 丁二醇（批号C11230698，纯度99%）购自上海麦克林生化科技有限公司;氯化胆碱（批号RH221064，纯度98%）、1，3-丙二醇（批号RH210167，纯度98%）、1，4- 丁二醇（批号RH273071，纯度99%）、丙二酸（批号RH246485，纯度99.5%）、DL-苹果酸（批号RH246485，纯度99.5%）、硫酸亚铁（批号RH246512，纯度98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）（ 批号RH207202，纯度≥98.5%）均购自上海易恩化学技术有限公司;维生素C（vitamin C，VC）（批号20210525，纯度≥99.7%）购自天津市鼎盛鑫化工有限公司;尿素（批号20190410，纯度≥99%）、葡萄糖（批号20190529，纯度≥99%）均购自天津市凯通化学试剂有限公司;乳酸（批号980826，纯度90%）购自天津市化学试剂一厂;乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量测定

采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件：采用Supersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～9min，90%B→83%B;9～18 min，83%B→80%B;18～30min，80%B）;流速为1.0 mL/min;柱温为30 ℃;检测器为紫外检测器;检测波长为330 nm;进样量为10 μL。按照2020 年版《中国药典》（四部）“9101 分析方法验证指导原则”进行方法学考察[12]，结果均满足要求。

2.2 NADESs的篩选

2.2.1 不同组成NADESs 的制备根据文献[13]方法，分别以氯化胆碱、多元醇和有机酸等为原料，以水为溶剂，制备11 种NAEDSs（表1），具体方法为：按照组成成分摩尔比将原料置于各自锥形瓶中，在80 ℃下加热搅拌，直至形成均匀透明的液体，冷却至室温后备用。

2.2.2 样品溶液的制备及提取效率的计算取肉苁蓉粉末0.3 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，分别加入不同组成的NADESs 及传统溶剂（50%甲醇，对照）适量，混匀后在一定温度下超声（功率为500 W，频率为40kHz）提取一定时间，冷却至室温后，以5 000 r/min 离心10 min，取上清液，用水稀释4 倍，然后过0.45 μm滤膜，收集滤液，即得样品溶液。按“2.1”项下方法测定各样品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量，并计算各成分的提取效率：提取效率（%）=（C×V×N/M×1 000）×100%。式中，C为样品中被测物质的质量浓度（mg/mL），V 为样品溶液的体积（mL），N为稀释倍数，M为肉苁蓉粉末的质量（g）。

2.2.3 最佳NADESs 的筛选NADESs 的组成成分会影响其理化性质，如极性、黏度、溶解度及表面张力等，从而决定其对目标成分的提取效率[14]。因此，本研究以松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率为考察指标筛选NADESs。结果显示，除NADES-7 和NADES-8 外，其余NADESs对目标成分的提取效率均优于50%甲醇。其中，以1，4-丁二醇和丙二酸为原料合成的NADES-11 对松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率达到最大值。因此，本研究选择NADES-11 作为最佳提取溶剂。结果见图1。

2.3 单因素实验优化提取工艺

在肉苁蓉提取的过程中，NADESs 组成成分的摩尔比、NADESs 含水量和液料比等因素对提取效率有着重要影响[15-16]。因此，本工艺优化实验中，笔者选择NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比、NADES-11含水量、液料比、提取时间和提取温度为因素进行考察。

2.3.1 NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比固定NADES-11 含水量为30%、液料比为15 mL/g、提取溫度为30 ℃、提取时间为40 min，考察不同比例1，4-丁二醇和丙二酸（摩尔比1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5）组成的NADES-11 对提取效率的影响，结果见图2A。如图2A所示，当NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2 时，松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率达到最大值。因此，本实验确定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2。

2.3.2 NADES-11 含水量固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2、液料比为15 mL/g、提取温度为30 ℃、提取时间为40 min，考察不同含水量（10%、20%、30%、40%、50%）的NADES-11 对提取效率的影响，结果见图2B。如图2B所示，当NADES-11 含水量为20%时，松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率达到最大值。因此，本实验确定NADES-11 的含水量为20%。

2.3.3 液料比固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2、提取温度为30 ℃、NADES-11 含水量为20%、提取时间为40 min，考察不同液料比（10、20、30、40、50 mL/g）对提取效率的影响，结果见图2C。如图2C所示，当液料比为30 mL/g 时，松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率达到最大值。因此，本实验确定液料比为30 mL/g。

2.3.4 提取时间固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2、提取温度为30 ℃、NADES-11 含水量为20%、液料比为30 mL/g，考察不同提取时间（20、30、40、50、60 min）对提取效率的影响，结果见图2D。如图2D所示，当提取时间为30 min 时，松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的总提取效率达到最大值。因此，本实验确定提取时间为30 min。

2.3.5 提取温度固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比为1 ∶2、提取时间为30 min、NADES-11 含水量为20%、液料比为30 mL/g，考察不同提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对提取效率的影响，结果见图2E。如图2E所示，不同提取温度对松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取效率影响差别不大。因此，本研究从降低能耗的角度考虑，选择在30 ℃下进行样品提取。

2.4 BBD实验联合GA优化提取工艺

2.4.1 BBD实验设计及结果本研究在单因素实验基础上，选择对松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷提取效率影响显著的3 个因素——NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比（X1）、NADES-11 含水量（X2）和液料比（X3）为自变量，以肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷总提取效率（Y）为响应值，使用DesignExpert 12.0 软件设计3 因素3 水平的BBD实验。BBD实验的因素与水平见表2，实验方案与结果见表3。

2.4.2 统计分析及模型拟合采用Design Expert 12.0软件对表3的实验数据进行多元线性回归拟合，得到3种目标成分的二次多项回归方程：Y=1.221 54+0.003 64X1+0.018 18X2 + 0.029 30X3 - 0.001 71X1X2 + 0.003 17X1X3 +0.000 06X2X3 - 0.013 38X12 - 0.000 43X22 - 0.000 64X32。同时，采用Design Expert 12.0软件对表3的实验数据进行方差分析，结果见表4。由表4 可知，模型回归系数R2为0.993 1、Radj2为0.984 2，表明该模型相关度良好，且与实测值能较好地拟合;总模型P<0.000 1，表明此模型的建立显著;此外，模型失拟项P>0.05，表明模型拟合良好。

2.4.3 响应面分析在响应曲面图中，曲面坡度越陡，表明该因素影响越显著;等高线图的形状反映了两两因素交互影响的强弱，椭圆形表示显著，圆形表示不显著[17]。运用Design Expert 12.0 软件绘制各因素对目标成分总提取效率影响的响应曲面图和等高线图（图3）。通过响应曲面图可知，3 个响应曲面均为开口向下的凸性曲面，表明最佳提取条件均在设定的条件范围内，且各因素对目标成分影响的强弱顺序为：X3>X1>X2。通过等高线图可知，X1与X2、X1与X3的交互影响较为显著。

2.4.4 GA优化及验证实验利用BBD 实验所建立的模型作为GA的适应度函数，使用Matlab R2020b 软件中的GA优化工具箱进一步对实验数据进行优化。在迭代57 次后，最佳适应度与平均适应度均基本保持稳定，表明总提取效率已达到最大值（图4）。GA优化求解的结果为：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比1 ∶2.49、NADES-11 含水量18.11%、液料比29.74 mL/g，最佳适应度（目标成分的总提取效率）为1.83%。为便于操作，本研究将实验条件修正为：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比1 ∶2.5、NADES-11 含水量18%、液料比30 mL/g。按修正后的实验条件进行3 次平行验证实验，得到3 种目标成分的总提取效率为（1.82 ±0.01）%，与预测值1.83%接近，表明优化的工艺条件准确、可行。

2.5 NADES-11 与传统溶剂的提取效果比较

2.5.1 提取效率的比較分别以NADES-11 为溶剂按“2.4.4”项下最优条件和以2020 年版《中国药典》（一部）肉苁蓉项下传统溶剂（50%甲醇）进行样品提取[18]，比较两者的提取效率。实验重复3 次。采用SPSS 18.0 软件中t 检验对数据进行统计分析，数据以x±s 表示，检验水准α=0.05。结果显示，NADES-11 对松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取效率均显著高于50%甲醇（P<0.05）。结果见图5。

2.5.2 抗氧化活性的比较按“2.5.1”项下方法制备2 种样品提取液，精密量取2 种样品提取液0、25、50、100、150、200、500、1 000 μL，分别置于10 mL量瓶中，用水稀释得质量浓度为0、0.08、0.17、0.33、0.50、0.67、1.67、3.34mg/mL 的供试品溶液。并制备相同质量浓度的VC 溶液，作为阳性对照检测液。

（1）DPPH 自由基清除实验。参考文献报道的方法[19]，吸取100 μL NADES-11 提取物、50%甲醇提取物、VC溶液于96 孔板中，加入0.38 mmol/L DPPH 溶液100μL，混匀，室温避光孵育30 min，然后采用酶标仪在517nm波长处检测各溶液的吸光度（A）。同时，将供试品溶液+DPPH溶剂（无水乙醇）的检测结果记为A0，样品溶剂（水）+DPPH 溶液的检测结果记为A1。计算各样品对DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A-A0）/A1]×100%。每个质量浓度设置3 个复孔。采用SPSS 18.0 软件计算各样品对DPPH 自由基的半数清除浓度（IC50）及抗坏血酸当量（ascorbic acid equivalent antioxidantcapacity，AEAC）。结果显示，在研究质量浓度范围内，各样品对DPPH自由基均有一定的清除活性，其强弱顺序依次为VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。结果见表5。

（2）羟基自由基清除实验。参考文献报道的方法[20]，取7.5 mmol/L的邻二氮菲20 μL、0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液40 μL和样品溶液30 μL于96 孔板中，混匀，再加入7.5 mmol/L 的FeSO4 溶液20 μL 和0.1%H2O2 溶液20 μL，在37 ℃下恒温反应60 min，采用酶标仪在536nm波长处检测A。同时，将样品溶剂（水）代替样品同法操作后所得结果记为A0;将样品溶剂（水）代替样品，同时以水代替0.1%H2O2同法操作后所得结果记为A1。计算各样品对羟基自由基的清除率：羟基自由基清除率（%）=（A-A0）/（A1-A0）×100%。每个质量浓度设置3个复孔。按照“2.5.2（1）”项下方法计算各样品对羟基自由基的IC50和AEAC。结果显示，在研究质量浓度范围内，各样品对羟基自由基均有一定的清除活性，其强弱顺序依次为VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。结果见表5。

3 讨论

NADESs作为一种新型的绿色可调节溶剂，与传统溶剂相比，具有较高的提取效率及良好的生物降解性、生物相容性、稳定性和可回收性等优点[21]。Dai 等[22]研究表明，与水和40%乙醇相比，NADESs 提高了红花中酚类物质在高温、光照和长期放置等条件下的稳定性。熊苏慧等[23]对以NADESs为溶剂得到的玉竹总黄酮提取液进行纯化回收，发现NADESs 可被回收再次利用，且回收后的NADESs 再次用于提取时也取得了较好的提取效率（回收利用率为94.56%）。并且，NADESs的组成成分在自然界中大量存在，具有成本低和生物可再生的特性。此外，NADESs 由天然的初级代谢物组成，被认为是低毒或无毒的环境友好型提取溶剂，可以直接纳入药物、食品等配方中，不需额外进行纯化[24-25]。故本研究使用NADESs 代替有机溶剂用于肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的提取，具有科学性和可行性。

本研究结果显示，不同组成的NADESs 对松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取效率不同，笔者认为主要是黏度不同导致的——黏度较低的NADESs有利于目标成分的扩散。因此，在NADES-11 含水量的考察中，随着其含水量的增加，黏度降低，目标成分提取效率也随之升高;然而当含水量大于20%时，目标成分提取效率呈降低趋势，这可能是由于过多的水会破坏NADES-11 的氢键网络并改变其极性。随着液料比的增加及提取时间的延长，目标成分的总提取效率均呈先升高后降低的趋势。合适的液料比有助于溶质中目标成分向溶剂扩散。过短的提取时间不足以破碎药物细胞壁，过长的提取时间则会使目标化合物发生降解。在单因素实验基础上，经BBD实验联合GA优化并进行修正后得NADES-11 的最佳工艺条件为：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩尔比1 ∶ 2.5、NADES-11 含水量18% 、液料比30 mL/g、提取时间30 min、提取温度30 ℃。经验证，目标成分总提取效率的实测值（1.82%）与预测值（1.83%）接近，表明模型优化工艺条件准确、可行。

综上所述，本研究以优化的NADESs 为提取溶剂，提取肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的工艺稳定、可行，符合天然产物绿色提取的理念。但是，由于药物处理量的大小悬殊，实验室和工业生产之间的差别较大，而本实验样品量较小，很难对NADESs工业提取中的许多因素进行充分考察。因此，本提取工艺若要应用于工业大生产，还应该经过实验室放大、中试和工业放大的数据验证。