PEG 模拟干旱胁迫下南酸枣幼苗对外源ABA 的生长生理响应
2022-07-15张建生
张建生
（潮州市生物多样性保护研究中心，广东 潮州 521000）
南酸枣（Choerospondias axillaris）属漆树科落叶阔叶乔木树种，在长江流域以南各省区广泛分布。南酸枣生长迅速，木材纹理美观，可制作家具和工艺品外；树皮、叶可提栲胶；果可生食、酿酒；果核可作为活性炭原料；茎皮纤维可作绳索；树皮、果入药还有消炎解毒、止血止痛之效，利用价值高，开发应用前景广阔[1-2]。在适宜生长环境下，南酸枣生长成林较快，但南酸枣对生境中水分条件要求较高，易受到干旱胁迫的影响，从而导致育林效果下降[3-4]。
干旱胁迫作为外界环境对植物生长发育不利的一种多维胁迫，能够引起植物表型、生理与分子水平等系列变化，从而导致光合作用的终止和新陈代谢的紊乱，最终造成植株死亡[5]。脱落酸（abscisic acid，简称ABA）是植物主要内源激素之一，研究发现ABA 对植物生长发育过程和逆境胁迫应答起重要作用，是植物关键的抗逆诱导因子[6]。有报道指出，施用外源ABA 可促进内源ABA 合成[7-8]，而内源ABA 可有效缓解干旱[9]。目前，有关南酸枣抗旱性方面研究较为少见。鉴于此，本研究以南酸枣幼苗为试验对象，通过施用外源ABA 方式，分析干旱胁迫下南酸枣幼苗有关生长生理指标的变化，旨在探讨外源ABA 在提升南酸枣抗旱性方面的作用，以期为干旱生境下南酸枣高效培育提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
于10 月中旬种实成熟期，采集形质优良成年母树上果实，用清水浸泡3 d，去除果肉，自然晾干后将种子贮存于4 ℃冰箱中。翌年2 月底，将种子先用0.5%的高锰酸钾浸泡30 min，流水冲洗干净后用40 ℃温水处理24 h，自然冷却后水选出饱满种子。采用行状点播方式进行苗床播种育苗，播种时把种子的小孔朝上，覆土厚度2～3 cm。待种子发芽出土时，每天浇水1 次，并适当遮阴。待种子长出幼苗时进行移植，以0.1%磷酸二氢钾和0.3%复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）为叶面肥，每株喷施50 mL、每周喷施1次、连续喷施6～8 次进行施肥管理，促进苗木生长发育。苗木移栽3 个月后，选择生长健壮、无病虫害、平均苗高15 cm 的苗木为试验苗，将植株上泥土冲洗干净后移至Hoagland 完全营养液中进行适应性培养待用。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计
本试验采用水培法，以1/2 Hoagland 营养液作为培养液，添加不同浓度的PEG 与外源ABA。为筛选适宜PEG 处理浓度，以0%（W0）、5%（W1）、10%（W2）、15%（W3）PEG 8 000 处理南酸枣幼苗4 周，每处理设置4 次重复，每重复40 株苗。观测不同浓度PEG 处理下苗木生长情况，并调查统计存活率。根据存活率变化趋势，选择10% PEG 8000（W2）作为本试验中与外源ABA 交互处理的PEG 浓度，即10%PEG+0～60 mg/L 外源ABA，其中ABA 设置0（A0）、15（A1）、30（A2）、60（A3）mg/L 4 个梯度（处理）。在外源ABA 与PEG 交互处理试验中，每处理3 次重复，每重复40 株苗，处理周期4 周。试验在控制环境条件下进行，温度（25±0.5）℃，相对湿度75%，光照强度400～450 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h；每周更换1 次培养液，每日充气1 次，每次40 min。
1.2.2 指标测定
幼苗存活率：于0%～15% PEG 胁迫处理1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d，分别统计各处理幼苗存活数量，根据存活株数占初始总株数百分比计算存活率。
为检测外源ABA 对干旱胁迫下南酸枣幼苗生长生理方面的影响，于0～60 mg/L ABA+10% PEG处理28 d 时，分别取样观测有关生长生理指标变化。具体指标包括：
内源ABA 与GAs 测定。采取植株中上部功能叶部位叶片进行内源ABA 与赤霉素（GAs）水平测定，各处理每重复采取叶样约1.0 g。使用仪器为Agilent 1290 液相色谱仪、Agilent 6460C 三重四极杆质谱仪和配电喷雾离子源，激素标准品为Sigma公司生产，色谱纯级。色谱条件和质谱条件参照王荣[10]的方法。
光合作用参数采用英国公司生产的一型光合作用仪于胁迫处理28 d 时采样测定。
叶绿素含量测定采用美国公司生产的便携式叶绿素速测仪于胁迫处理28 d 时，各处理每重复选取植株中上部5 片功能叶进行活体测定。
叶绿体显微构造观察：将叶片横切成3 mm×4 mm 大小后用2% OsO4固定，进行酒精梯度脱水后包埋于环氧树脂（Epon 812）中，最后采用超薄切片机Leica-ULTRACUT 型切片。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，于JEM-1230 型电子透射显微镜下观察并照相。
相对水分亏缺（RWD）：各处理每重复选取3 株代表性植株，分别称取其叶鲜重（B0）后用水浸泡8 h，再称其饱和鲜重（B1），然后在105 ℃下烘8 h 称重（B2）。计算：RWD（%）=（B1-B0）/（B1-B2）×100。
生物量增量：在PEG 处理前和处理结束时，各处理每重复分别选出5 株完整性植株，将其冼净后，在80 ℃烘箱内烘干至衡重，以处理结束时与处理前植物干物重表示处理期间植株生物量增量。
1.3 数据处理
采用SPSS19.0 进行数据分析。不同处理间差异显著性检验采用Duncan 新复极差法进行多重比较（p<0.05）。
2 结果与分析
2.1 PEG 处理下幼苗存活率变化
为筛选本试验中供试南酸枣幼苗的PEG 处理阈值，以0%~15%PEG 进行4 周的干旱胁迫处理。从图1 可知，不同浓度PEG 对南酸枣幼苗存活率影响差异显著。在正常无PEG 的对照处理（W0）下，苗木生长健壮，处理期内未出现任何苗木死亡，存活率为100%；在5%~15%PEG 处理下，苗木出现了不同程度死亡。其中，在15%PEG 处理（W3）下，苗木死亡进程较快，在处理21 d 时存活率已达0%，而5%（W1）和10%PEG（W2）处理14 d 时，苗木存活率较为接近，为90%～93%。但随着胁迫时间延长至28 d 时，10% PEG 处理下存活率仅为9%，较胁迫21 d 时下降了74%；5% PEG 处理下存活率为48%，仅较胁迫21 d 时下降了17%。这说明，15%PEG 处理下南酸枣幼苗遭受的干旱胁迫非常严重，死亡进程太快，超过了其所能承受的PEG 处理阈值。在10% PEG 处理下，苗木早期（0～14 d）表现出了较强的耐受性，在21～28 d 的后期处理中则表现出了耐受性线性大幅下降的趋势。故此，为探讨外源ABA 对南酸枣幼苗的干旱缓解作用，本试验选择以10% PEG 作为外源ABA 与PEG 交互处理中干旱胁迫处理条件。
2.2 外源ABA 与PEG 处理下叶片内源ABA 与GAs 水平变化
外源ABA 干旱缓解作用机制在于诱导了内源ABA 水平的变化[11]，而内源ABA 与GAs 具有拮抗性。GAs 具有类似于生长素生理功能，能促进细胞伸长，调控植物生长发育。为检测施用外源ABA 对南酸枣幼苗内源ABA 及拮抗激素GAs 的影响，本试验检测了10%PEG+0～60 mg/L ABA 4 个处理下南酸枣幼苗叶片内源ABA 与GAs 水平的变化。从图2 可以看出，不同处理间内源ABA 和GAs 浓度差异显著。其中，内源ABA 浓度具有随着外源ABA 施用量增加而增大的趋势；而GAs 浓度在10% PEG+0 mg/L ABA（W2A0）和10% PEG+15 mg/L ABA（W2A1）处理间无差异，且显著高于10% PEG+30～60 mg/L ABA处理（W2A2和W2A3）。这说明，高浓度外源ABA 显著增加了ABA 水平，降低了GAs 水平。
图2 外源ABA 与PEG 处理下南酸枣幼苗叶片内源ABA 与GAs 水平变化
2.3 外源ABA 与PEG 处理下叶片光合特性变化
光合作用是一切植物能量和物质的来源，在植物生长发育中发挥至关重要作用[12]。从10%PEG+0～60 mg/L ABA 处理下南酸枣幼苗叶片光合特性变化来看（表1），净光合速率（Pn）大小表现为：W2A2>W2A3>W2A1>W2A0，蒸腾速率（Tr）大小表现为：W2A2
2.4 外源ABA 与PEG 处理下叶绿体构造变化
表1 外源ABA 与PEG 处理下南酸枣叶片光合特性变化
叶绿体是植物外源进行光合作用的重要场所。从外源ABA 与PEG 交互处理下叶绿体超微结构变化来看，未施加外源ABA 时，叶绿体类囊体片层结构发生了明显的降解（图3 A）；在15 mg/L 外源ABA 处理下，类囊体片层降解程度稍有减弱，但片层间有明显空隙、排列疏松（图3 B）；在30 mg/L 外源ABA 作用下，叶绿体结构完整且紧靠细胞壁、胞间质浓厚（图3 C）；在60 mg/L 外源ABA 作用下，叶绿体结构完整但类囊体片层间有一定的空隙（图3 D）。这说明，在PEG 胁迫下，使用外源ABA 能促进类囊体片层降解，保护叶绿体结构完整性，整体上在30 mg/L外源ABA 作用下效果最佳。
图3 外源ABA 与PEG 处理下南酸枣幼苗叶片叶绿体构造变化
2.5 外源ABA 与PEG 处理下叶片相对水分亏缺及植株生物量变化
水分亏缺程度和生物量变化是反映植物遭受干旱胁迫程度最客观的表型指标[13]。从图4 中外源ABA 与PEG 处理下南酸枣幼苗叶片水分亏缺和植株生物量增量的变化来看，未施加外源ABA 时，叶片相对水分亏缺率达77%，单株生物量增量仅为0.1 g；而在施用30～60 mg/L 外源ABA 时，叶片相对水分亏缺率降低了44%～56%，生物量增加了404%～741%。整体上看，在30 mg/L 外源ABA 作用下，叶片相对水分亏缺率最小（34%），生物量最大（0.71 g/株）。这反映了在10% PEG 作用下，南酸枣幼苗遭受了严重的干旱胁迫，但通过施用30 mg/L 外源ABA 能显著缓解其受到的胁迫伤害。
图4 外源ABA 与PEG 处理下南酸枣幼苗叶片相对水分亏缺及植株生物量变化
3 结论与讨论
PEG 作为一种高分子化合物，常被应用于模拟植物干旱胁迫试验，但不同分子量PEG、不同植物种类，对PEG 干旱胁迫响应也各不相同。在5%～15% PEG 作用下，本试验供试南酸枣幼苗均遭受了明显的干旱胁迫伤害。从胁迫进程来看，5% PEG 过慢，15% PEG 太快，而10% PEG 处理南酸枣幼苗，其存活率的变化趋势表现为“先慢后快”，更符合自然界中植物遭受干旱胁迫时产生的胁迫伤害变化。因此，以10% PEG 8 000 通过水培的方式更易获得可靠的试验数据。
研究证实，外源性ABA 通过诱导内源ABA 水平上升从而实现对植物抗旱性有效提升[11]。在10%PEG 处理下，通过施加15～60 mg/L 外源ABA，显著增加了南酸枣幼苗叶片中内源ABA 水平，这与以往研究结果一致。干旱胁迫对光合作用具有明显影响，植物在干旱胁迫下保持较高的光合效率尤为重要。ABA 作为植物逆境胁迫的重要调控因子，其主要是通过调节气孔关闭，减少蒸腾失水，提高水分利用效率，增加对CO2的响应，提升光合能力[14]。笔者发现，在30 mg/L 外源ABA 作用下，南酸枣幼苗Gs 与Tr最小，Pn、WUE 最大。叶绿体完整性直接影响植物光合能力。通过施用30～60 mg/L 外源ABA，干旱胁迫下南酸枣幼苗叶片的叶绿体结构完整性明显改善，叶绿素含量显著增加。这表明，外施适宜浓度ABA 对干旱胁迫下南酸枣幼苗光合作用具有正向促进作用，同时在稳定光合结构方面发挥了重要作用。
激素作为植物生长发育的重要调节物质，广泛参与植物生理代谢过程。研究表明，不同种类激素之间存在着相互促进和相互拮抗的生理效应，激素间的动态平衡对植物生长发育的调节作用更为关键[15]。GAs 作为外源ABA 拮抗性激素，在植物细胞伸长、开花等生长发育中起主导作用[16]。本试验研究表明，30～60 mg/L 外源ABA 显著降低了南酸枣幼苗叶片中GAs 含量。从外源ABA 与PEG 交互处理下植株生物量变化来看，随着外源ABA 施用浓度增加生物量增量并未表现出增加的趋势，其最大值出现在30 mg/L 外源ABA；在60 mg/L 外源ABA 处理下，生物量较30 mg/L 外源ABA 处理降低了40%，这可能与该处理下内源GAs 水平明显偏低，从而导致植株生长发育受到抑制有关。这表明，今后在施用外源ABA 时，应考虑内源激素间平衡。
