SLC2A9基因rs13137074位点双荧光素酶报告系统的构建及其对基因活性的影响

陈邬锦,玛依娜·卡哈尔,田婷婷,李 瑞,梁美婷,4,贺 怡,4,崔月娜,刘业洲,白 冰,孙玉萍△

新疆医科大学基础医学院：1.形态中心；2.微生物教研室；3.人体寄生虫学教研室，新疆乌鲁木齐 830011；4.新疆第二医学院，新疆克拉玛依 834000

高尿酸血症(HUA)可导致痛风，与慢性炎症及衰老的机制存在关联[1]。人体每天约2/3的尿酸经肾脏排出，肾脏中参与尿酸排泄的转运体可大致分为尿酸再吸收转运体和排泄转运体2类[2-3]。葡萄糖易化转运蛋白-9(SLC2A9)属于尿酸再吸收转运体位于肾小管上皮细胞基侧，参与尿酸盐的体内转运和排出[4]。对SLC2A9基因调控区域的功能研究可阐释HUA的发病机制[5]。本课题组前期对SLC2A9基因单核苷酸多态性(SNP)的测序发现rs13137074位点的多态性与尿酸代谢存在关联[6]。有研究指出该位点的基因多态性可能与机体尿酸代谢紊乱相关[7]，但并未具体阐明rs13137074位点突变是否与SLC2A9基因的转录存在关联。因此，本研究通过定点突变技术联合双荧光素酶报告系统观察rs13137074位点对SLC2A9基因转录的影响，为进一步了解HUA的发病机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料 人胚胎肾细胞293T细胞株购自青旗(上海)生物技术发展有限公司。质粒提取试剂盒DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，pGL3-Basic质粒、pGL3-Control质粒、pGL3-rs13137074-A重组质粒、pRL-TK内参质粒及pAcGFP1-C1质粒均购自通用生物系统(安徽)有限公司，KpnⅠ、XhoⅠ限制性内切酶购自美国BioLabs公司，T4 DNA Ligase购自Takara(大连)生物技术有限公司，Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher公司，引物、DNA片段合成及胶回收试剂盒等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1双荧光素酶报告基因质粒构建

1.2.2SLC2A9基因rs13137074位点野生型及突变质粒构建 (1)基因位点合成：将KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点分别合成至rs13137074位点的野生型和突变型上、下游，备用。(2)质粒连接：将空载质粒pGL3-Basic 900 ng加入由CutSmart 5 μL、KpnⅠ及XhoⅠ酶各1 μL、ddH2O 42 μL共同组成的酶切体系中，37 ℃水浴15 min，再60 ℃水浴30 min，取出后4 ℃过夜保存。取上述合成片段3 μL、开链pGL3-Basic质粒1 μL加入由10×ligation 2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL及ddH2O 3 μL组成的连接体系中4 ℃连接过夜。(3)质粒转导：取连接好的质粒2 μL与50 μL DH5α感受态细胞混悬液混合后冰上静置15 min。将上述混合物全部加入电击杯中，于25 μF、200 Ω、2 500 U、2 mm条件下电击，取出后迅速加入500 μL LB培养液置摇床160 r/min 37 ℃孵育1 h。取出培养液将其涂布于含有氨苄西林(AMP)的平板中37 ℃过夜培养，挑取单个菌落液体扩增备用。(4)无内毒素质粒提取:取上述培养液5 mL，以3 000 r/min离心10 min弃上清液，加入1 mL Bacterial Endotoxin Erasol颠倒混匀4～6次12 000 r/min离心1 min弃上清液，重复清洗2次后用参照质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。(5)质粒鉴定：将抽提质粒参照(2)酶切鉴定成功后送测序、并与参比序列比对完全一致后备用。

1.2.3双荧光素酶报告基因检测转录活性检测[8](1)细胞复苏与传代：将人胚胎肾细胞(293T)从液氮中取出后遵循“慢冻快融”原理进行复苏和冻存，传代标准为细胞贴壁融合达90%时。细胞培养液为DMEM完全培养基(含双抗及10%胎牛血清)。培养特殊要求为饱和湿度。(2)质粒转染条件摸索：将含有DMEM培养基50 μL，1 μL水平为1～5 μg/μL的哺乳动物表达载体(pAcGFP1-C1)质粒，2 μL P3000TM转染体系中加入0.375、0.750 μL Lipofectamine 3000试剂并各自设立24 h组及48 h组，共4组每组3个平行样品，混匀后室温静置15 min备用。将上述混合液全部转移至贴壁生长好的293T细胞培养板中置细胞培养箱中分别按照24 h和48 h继续培养。(3)实验分组：共设阳性对照组(pGL3-Control质粒)、阴性对照组(空载pGL3-Basic质粒)、SLC2A9基因rs13137074位点野生型组(pGL3-SLC2A9-WT质粒)和SLC2A9基因rs13137074位点突变型组(pGL3-rs13137074-A质粒)4组，每组3个平行样进行检测。每组按照均20:1的比例加入目标质粒及pRL-TK内参质粒。(4)双荧光素酶活性检测：按照(2)所得最佳培养时间取出转染细胞，平衡至室温后取150 μL细胞加入装有150 μL已制备的Dual-Glo Luciferase试剂的EP管中室温静置30 min。待细胞充分裂解后吹打混匀后避光条件下取75 μL加入黑色96孔板中，静置30 min后检测萤火虫荧光素酶荧光值。随后向每孔添加已制备的Dual-Glo Stop& Glo试剂75 μL静置30 min后检测海肾荧光素酶的荧光值。荧光素酶活性=海肾荧光素酶荧光值/萤火虫荧光素酶的荧光值。

2 结 果

2.1双酶切鉴定结果 将野生型质粒pGL3-SLC2A9-WT与突变型质粒pGL3-rs13137074-A经双酶切后电泳显示目标片段连接成功，均出现了2条明显的条带见图1。

注：A为野生型质粒酶切电泳图；B为突变型质粒酶切电泳图；M为分子标准带；1为双酶切前野生型质粒；2为双酶切后野生型质粒；3为双酶切前突变型质粒；4为双酶切后突变型质粒。

2.2质粒测序结果 野生型质粒pGL3-SLC2A9-WT测序结果经分析与参比序列完全一致，见图2。

图2 pGL3-SLC2A9-WT部分测序峰图

2.3质粒转染条件摸索 经检测转染试剂Lipofectamine 3000在0.75 μL/孔(24孔板)效果最好，即每1mL培养液中需加入1.5 μL Lipofectamine 3000试剂，最佳转染时间为48 h。

2.4SLC2A9基因rs13137074位点对转录活性影响检测结果 经双荧光素检测可得转染rs13137074位点突变型报告载体，与野生型载体相比，其荧光素酶活性显著下调了23.60%，见表1。

表1 双荧光素酶检测SLC2A9基因rs13137074位点对转录活性的影响

3 讨 论

尿酸是嘌呤代谢的终产物，在体内主要以尿酸盐的形成存在于血清中，作为一种氧自由基的清除剂，参与机体多种细胞的抗氧化、抗衰老及代谢过程[9]。体内过高浓度的尿酸会引起高尿酸血症、慢性肾病及痛风等疾病；而过低浓度的尿酸则会引起人体出现多种炎症及与诱发抗氧化能力下降相关疾病，如阿尔茨海默症、帕金森及多发性硬化症等[10]。人体尿酸平衡的维持主要依赖于肾脏对尿酸盐的重吸收和排泄，SLC2A9作为肾脏尿酸盐排泄途径中重要转运体之一[11]，该基因的突变与肾脏引起的HUA存在显著关联[12]。SLC2A9基因除了在肾脏表达外还可表达于肝脏、胎盘和胰腺等多种细胞和器官中，同时也是癌症抑制因子P53的直接靶基因，可有助于抗氧化防御作用[13]，目前报道的该基因的调控相关蛋白只有核受体家族成员(HNF)4α及PDZ结构域1(PDZK1)[14]。但其他与SLC2A9调控相关的基因尚未被深入研究，多项研究指出SLC2A9的多个位点SNP与血清尿酸水平存在关联，但大多位于内含子非编码区，且这些位点改变血尿酸水平的分子机制尚不清楚[15-16]。本课题前期在对本地区居民SLC2A9基因功能区突变与HUA的关联研究中发现多个SNP与尿酸代谢异常存在关联，但未涉及rs13137074位点SLC2A9基因转录活性的探索[6]。本研究定点突变rs13137074位点并通过双荧光素酶检测，发现该位点发生突变使得SLC2A9基因转录活性下调了23.60%。说明rs13137074位点位于SLC2A9基因转录的调控区，该基因的突变与SLC2A9基因转录存在明显关联。本研究的开展进一步证实了rs13137074位点SNP可影响SLC2A9基因的表达进而影响人群血尿酸水平。