imFISH循环肿瘤细胞检测结果与恶性肿瘤患者临床特征及预后的关系*

李 敏，豆小文，刘 丹，熊 丹，张秀明△

1.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232000；2.深圳市罗湖医院集团罗湖区人民医院/深圳大学第三附属医院医学检验科，广东深圳 518001；3.深圳市罗湖医院集团罗湖区人民医院/深圳大学第三附属医院甲乳外科，广东深圳 518001

2020年，全球新发恶性肿瘤病例约1 930万例，死亡病例达1 000万例，呈逐年增长趋势，全球女性乳腺癌新发病率已超过肺癌成为排名第一的恶性肿瘤；我国乳腺癌发病例数高居全球第一位，死亡率位居前列的恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[1]。病理活检虽为诊断恶性肿瘤的金标准，但对患者有侵入性损伤，取材位置有限，无法动态监测术后肿瘤复发转移；影像学可动态监测患者病情，但对微小病变无法准确识别(可检出病变的最小直径为2～3 mm)，对患者有放射性损伤，且检查结果会受判断者的主观因素影响。因此，寻找灵敏、便捷的诊断靶标以实现对恶性肿瘤的早期诊断、复发转移动态监测、预后评估等是当前的研究热点。循环肿瘤细胞(CTCs)虽不是血液循环中唯一的肿瘤衍生物，但它们包含一群转移性前体[2-3]，对疾病进展至关重要，可提供癌症生物学的信息，用于监测疾病进展，并有可能用于指导个性化的癌症治疗。目前，CTCs的研究主要集中在方法学开发阶段，如膜过滤法[4]、免疫磁珠法[5]、基于物理或生物特性和免疫细胞化学法的微流控芯片技术[6-7]和流式细胞术等，尚未进行广泛的临床应用，其应用价值仍在探索中。有研究报道，可将免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光原位杂交术(imFISH)在临床上应用于各种恶性肿瘤CTCs的检测，但以往的研究大多仅聚焦于其在单一恶性肿瘤中的应用价值[8-9]。本研究采用imFISH CTCs检测技术，考察了多种常见恶性肿瘤患者的外周血CTCs阳性率，分析了CTCs阳性率与临床分期、病灶最大径、有无淋巴结转移、有无远处转移以及与常见肿瘤标志物之间的关系，旨在探讨CTCs检测在多种恶性肿瘤诊断及预后判断中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2018年6月至2020年11月于深圳市罗湖医院集团罗湖区人民医院就诊的恶性肿瘤患者的临床资料，包括CTCs检测结果、临床病理资料及实验室检查结果等。纳入经病理活检证实且有明确病史资料的恶性肿瘤患者共235例，其中乳腺癌80例、肺癌53例、结直肠癌31例、心脏肉瘤14例、胃癌12例、子宫内膜癌12例、肝癌7例、食管癌7例、输尿管恶性肿瘤6例、宫颈癌5例、胰腺癌5例、前列腺癌2例、肾细胞癌1例。患者中位年龄56岁，年龄范围28～85岁；男107例、女128例。外周血标本采集时间点包括未接受治疗(外科手术、放化疗、新辅助治疗等)、术后化疗及复发转移期。

1.2仪器与试剂 包括ACD保养管(美国BD公司)、低速离心机(上海安亭科学仪器厂)、荧光显微镜(日本Nikon公司)、杂交仪(Dako公司)、Cyttel®染色体扩增型CTCs检测系统(江苏莱尔生物医药科技有限公司，采用免疫磁珠阴性富集联合imFISH检测技术)。

1.3方法

1.3.1CTCs阴性富集 足量采集外周血至ACD保养管(5 mL)2管(其中1支用于复查)。采血完毕后立即轻轻颠倒混匀8次，24 h内于室温(15～30 ℃)进行CTCs阴性富集。严格参考说明书进行操作，主要步骤：(1)以600×g离心5 min，分离并去除血浆；(2)将红细胞裂解液加至标本中，混匀，裂解红细胞8 min后以600×g离心5 min，收集沉淀的细胞团；(3)在收集的细胞团中加入100 μL免疫磁微粒，室温振荡孵育20 min，去除白细胞；(4)磁吸附，收集细胞悬液，涂于玻片固定并干燥。

1.3.2imFISH检测 在制备好的玻片标本上滴加CEP8探针10 μL，于杂交仪中变性(75 ℃，5 min)、杂交(37 ℃，1.5 h)。滴加抗CD45抗体孵育1 h后，加DAPI染核，封片，于荧光显微镜下观察。

1.3.3鉴定与判读 将CEP8+CD45-DAPI+的细胞计为CTCs(CEP8荧光探针信号点≥3个)，健康人CTCs计数的参考范围为0～1个/3.2 mL，CTCs≥2个/3.2 mL的患者为CTCs阳性。

1.4统计学处理 采用SPSS24.0软件进行统计学处理。计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism软件绘制数据统计图。

2 结 果

2.1恶性肿瘤患者CTCs阳性率 恶性肿瘤患者CTCs总阳性率为65.53%(154/235)。在235例恶性肿瘤患者中，未接受相关治疗患者48例，其CTCs阳性率为54.17%(26/48)，与术后化疗患者CTCs阳性率[61.79%(76/123)]比较，差异无统计学意义(χ2=0.833，P=0.361)。经CT检查确诊为复发转移的患者有64例，CTCs阳性率为81.25%(52/64)。不同类型恶性肿瘤患者CTCs检测结果：乳腺癌患者CTCs阳性率为41.25%(33/80)，肺癌患者CTCs阳性率为73.58%(39/53)，两者CTCs阳性率比较差异有统计学意义(χ2=13.425，P<0.05)。由于其他癌种的病例数较少，故未纳入统计。乳腺癌与肺癌患者中未接受相关治疗、术后化疗和复发转移的3类患者CTCs阳性率见图1。

图1 乳腺癌和肺癌CTCs阳性率变化

2.2CTCs与肿瘤临床特征的关系 不同临床分期患者CTCs阳性率：Ⅰ～Ⅱ期患者阳性率最低，为38.37%；Ⅲ期患者CTCs阳性率为69.49%；Ⅳ期患者CTCs阳性率最高，为88.89%；Ⅰ～Ⅱ期与Ⅳ期患者CTCs阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=50.232，P<0.05)。CTCs计数最多(12个/3.2 mL)的患者病灶最大径>5 cm，有淋巴结和远处转移，临床分期为Ⅳ期。CTCs阳性率与临床分期、病灶最大径、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 CTCs与235例恶性肿瘤患者的临床分期、80例乳腺癌分子分型的关系

2.3血清肿瘤标志物水平与CTCs阳性率的关系 不同癌胚抗原(CEA)和糖类抗原(CA)153水平的乳腺癌患者CTCs阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同CEA、CA125、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和铁蛋白水平的肺癌患者CTCs阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CTCs阳性与乳腺癌和肺癌常见肿瘤标志物之间的关系

2.4动态监测6例恶性肿瘤患者的CTCs计数 选取CTCs连续监测4次以上且临床分期处于Ⅱ期以上的6例常见恶性肿瘤患者，以CTCs核形变化情况将其分为核体积变化稳定组和核体积变化波动组进行观察，观察患者CTCs计数、核形态变化情况、疾病进展情况、治疗反应。(1)CTCs核体积变化稳定组。患者2为肺腺癌患者，监测过程中，共检出CTCs 3次；第1次CTCs核体积大，后两次核体积较小；该患者行左肺腺癌术后化疗，CTCs从6个/3.2 mL降至3个/3.2 mL，2个月后降为1个/3.2 mL，；疾病缓解，接受靶向治疗，预后良好。患者4为子宫内膜癌患者，在监测过程中，共检出CTCs 8次；该患者子宫内膜癌术后接受放疗并行辅助化疗，CTCs检测显示核体积较小，数量增加，1年后复发转移，CTCs增加至7个/3.2 mL；行肿瘤免疫治疗后CTCs降至1个/3.2 mL，提示预后良好，免疫治疗效果有效。患者5为乳腺癌患者，监测过程中，共检出CTCs 2次，核体积基本无变化；该患者左乳癌术后行内分泌治疗，CTCs为2个/3.2 mL；随着治疗的进行，CTCs降至0，患者预后良好。见图3。(2)CTCs核体积变化波动组。患者1为升结肠中分化腺癌患者，连续9次监测均检出CTCs；该患者术后复发转移，CTCs核体积大，连续6次CTCs监测，核体积变化明显，行姑息性化疗后CTCs核体积先减小后增大，最后患者死亡。患者3为右肺上叶中低分化鳞状细胞癌患者，连续13次监测，均检出CTCs；该患者确诊后，未行手术切除，CTCs核体积较大；3个月后体积减小，CTCs计数降低至2个/3.2 mL，但2个月后CTCs计数增加至4个/3.2 mL，该患者疾病进展，接受肿瘤免疫治疗。患者6为胃癌术后多发肝转移，连续8次监测，均检出CTCs，核体积随疾病进展变化频率增大；该患者行化疗后，CTCs计数均≥4个/3.2 mL，3个月后CTCs达到12个/3.2 mL，最后患者死亡。

注：患者1为结肠癌患者；患者2、3为肺癌患者；患者4为子宫内膜癌患者；患者5为乳腺癌患者；患者6为胃癌患者。

3 讨 论

恶性肿瘤的早期、伴随诊断及预后监测一直是临床关注焦点，随着CTCs检测技术从科研走向临床，CTCs检测取材便捷、易于动态监测和有助于预后评估的特点使其在临床中的应用受到关注。本研究中，imFISH CTCs检测多类恶性肿瘤的总阳性率为65.53%，与赵振坤等[10]报道相近(CTCs阳性率为76.6%)。CTCs检测技术最早应用于乳腺癌的检测，因此相关文献报道较多，然而王瑞娟等[11]报道乳腺癌CTCs阳性率不高(阳性率为55.56%)，与本研究结果相似(阳性率仅为41.25%)，而与LOEIAN等[12]运用纳米管-CTCs芯片检测Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌CTCs阳性率为100.0%的结果有明显差异。上述结果提示，CTCs阳性率与检测方法密切相关，本研究采用的CTCs阴性富集法联合8号染色体拷贝数变异的imFISH方法在乳腺癌中的诊断灵敏度可能还有待提高。本研究中，复发转移患者CTCs阳性率为81.25%，与未接受相关治疗和术后化疗患者有明显差异，这表明CTCs检测有助于监测癌症患者的复发转移，这可能与CTCs在转移过程中发生上皮间质转化(EMT)和CTCs具备肿瘤干细胞的特性有关[13]。

本研究中，CTCs与病灶最大径、有无淋巴结转移、有无远处转移、临床分期等有关，与以往研究结果一致[14-15]。虽然临床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者CTCs阳性率(38.37%)低于Ⅳ期(88.89%)，但这也表明早期恶性肿瘤患者外周血即已存在CTCs，随着疾病的恶化，CTCs阳性率升高。有淋巴结转移者和有远处转移者其CTCs阳性率高于未发生转移患者，这表明若CTCs数量增多则提示肿瘤存在转移的可能性。此外，本研究分析了80例乳腺癌患者CTCs的存在与乳腺癌Her-2分型及三阴性乳腺癌的关系，结果显示CTCs的阳性率在Her-2阴性与Her-2阳性乳腺癌之间无明显差异，在三阴型与非三阴型乳腺癌间也无明显差异，与张娜贤等[16]等运用imFISH检测CTCs所得到的结果相同，提示imFISH CTCs检测尚不能区分不同乳腺癌分型。

血清学肿瘤标志物的检测虽在特异度和敏感度方面欠佳，但因其检测简便，已作为常规检测项目用于恶性肿瘤的早期诊断、治疗监测和复发转移等。本研究分析了乳腺癌和肺癌的CTCs阳性率与常见肿瘤标志物(CEA、CA125、CA153、NSE、CYFRA21-1和铁蛋白)检测结果的关系，结果表明CTCs与上述肿瘤标志物的检测结果均无相关性。乳腺癌中的结果与赵振坤等[10]的报道相同，而肺癌中的结果与TAN等[17]的报道不相同(该研究认为肺癌患者CTCs与CEA、CA125、CA153检测结果存在一定相关性)，与ZHENG等[18]的报道也不相同(该研究认为CTCs与CEA的检测结果有相关性，并将两者的检测联合应用于指导肺癌患者治疗)。本研究表明，CTCs作为恶性肿瘤患者综合监测的指标可能优于现有的常见血清肿瘤标志物，但要还需进一步进行大样本量的统计分析。

本研究使用的CTCs检测方法对细胞的大小、形态无影响，因此分析了6例连续检测CTCs的恶性肿瘤患者。结果显示，终点事件为预后不良或死亡的患者，即使在治疗期间其CTCs细胞核体积变化也无规律，大小变化频繁，且CTCs计数也变化不定；而预后良好者，在治疗期间CTCs细胞核体积变化大多为减小(患者5虽然2次检出CTCs细胞核体积无明显改变，但这可能与两次检测间期短且检测次数少有关；患者4发生复发转移时，CTCs细胞核体积稍有增大且CTCs计数增加，但随治疗的继续进行，CTCs数量降为2个/3.2 mL以下)。本研究表明，CTCs细胞核体积变化规律及检出数量可以预测肿瘤患者复发转移，尤其可作为预后判断的重要指标之一。

本研究不足之处在于纳入研究的各类恶性肿瘤临床病例样本量不够大。本研究表明，CTCs的阳性率可能为恶性肿瘤患者的临床分期、复发转移的预测提供参考，CTCs的数量和细胞核体积可能成为评估复发转移、治疗效果及预后判断的指标。