乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者外周血miR-200a、miR-451a水平及临床意义

朱 江，李海渊，董海英

河北省秦皇岛市第二医院，河北秦皇岛 066600

慢加急性肝衰竭(ACLF)作为一种严重肝脏损伤，临床主要表现为凝血功能障碍与黄疸，并伴有腹水、肝性脑病等并发症，发病急骤，病死率较高[1-3]。ACLF病理基础可能是肝硬化，也可能是无肝硬化的慢性肝病，我国ACLF最常见病因为乙型肝炎病毒(HBV)感染，被称为乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)[4-5]。HBV-ACLF预后较差，调查显示其28 d病死率为其他慢性肝病的15倍[6]，因此迫切需要筛选出生物学标志物用于诊断HBV-ACLF及评估HBV-ACLF患者预后，为治疗方案制订提供依据。循环中微小RNA(miRNA)可在血清中稳定存在，不仅可作为多种疾病的诊断标志物，还可作为疾病预后评估的新指标、治疗的新靶标[7-8]。目前，已有相关研究指出，miR-200a、miR-451a在HBV-ACLF患者血清中水平异常[9-10]，但未对HBV-ACLF患者miR-200a、miR-451a水平改变的临床意义进行更加深入的探讨。基于此，本研究检测了HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平，并进一步探讨了其临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2017年7月至2021年3月收治的60例HBV-ACLF患者作为观察组，男34例、女26例，年龄45～78岁、平均(61.54±8.25)岁。另选取同期本院收治的60例慢性乙型肝炎(CHB)患者作为对照组，男31例、女29例，年龄44～76岁、平均(31.15±9.26)岁。两组年龄、性别等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会审核批准，伦理批号：QEYLL(医)2019001001。患者及其家属均对本研究知情同意。纳入标准：CHB的诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中相关诊断标准[11]；HBV-ACLF的诊断符合《肝衰竭诊治指南(2018年版)》中相关诊断标准[12]，并自愿签署同意书。排除标准：患其他病毒性肝炎；伴有结缔组织疾病；合并恶性肿瘤；既往有酒精性肝病、自身免疫性肝病；纳入研究前3个月内接受了糖皮质激素治疗。根据1个月的短期预后情况又将观察组的HBV-ACLF患者分为死亡组(15例)和生存组(45例)。

1.2方法 纳入研究的患者均于入院第2天清晨空腹状态下采集2管5 mL静脉血。一管于4 ℃环境下，以3 000 r/min离心处理15 min，分离血清，置于-80 ℃储存待检，采用日本AU2700型全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平，以实时荧光定量PCR测定HBV-DNA水平。另一管室温下静置30 min后，以1 500 r/min离心处理20 min，分离血清，置于-80 ℃下待检；采用Trizol提取外周血总RNA，以紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度，反转录获得cDNA，置于-20 ℃环境下保存备用，采用实时荧光定量PCR检测外周血miR-200a、miR-451a水平，引物由广州锐博生物工程有限公司合成，采用2-ΔΔCT法对外周血miR-200a、miR-451a的相对水平进行定量分析。

1.3统计学处理 数据采用SPSS21.0软件处理。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson相关进行相关性分析；采用Logistic回归进行影响因素分析；预测价值分析采用受试者工作特征(ROC)曲线，获取曲线下面积(AUC)、置信区间、灵敏度、特异度及截断值，对两项指标联合检测实施Logistic二元回归拟合，返回预测概率Logit(P)，将其作为独立检验变量。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组外周血miR-200a、miR-451a水平比较 观察组外周血miR-200a水平高于对照组，miR-451a水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组外周血miR-200a、miR-451a水平比较

2.2两组相关生化指标水平比较 观察组ALT、AST、TBIL水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组ALB、HDL-C、LDL-C、TC、TG及HBV-DNA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组相关生化指标水平比较

组别nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HBV-DNA(lg copy/mL)观察组601.65±0.323.33±0.353.50±0.571.59±0.575.37±0.77对照组601.69±0.273.35±0.593.54±0.601.81±0.695.27±0.64t0.7400.2260.3741.9040.774P0.4610.8220.7090.0590.441

2.3外周血miR-200a、miR-451a水平与相关生化指标的相关性分析 Pearson相关性分析表明，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平与ALT、AST、TBIL水平呈正相关(r=0.597、0.598、0.584，P<0.05)，miR-451a与ALT、AST、TBIL水平呈负相关关系(r=-0.607、-0.613、-0.592，P<0.05)。HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平与ALB、HDL-C、LDL-C、TC、TG及HBV-DNA均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 外周血miR-200a、miR-451a水平与相关生化指标相关性分析

2.4外周血miR-200a、miR-451a水平对HBV-ACLF的诊断价值 以观察组作为阳性样本，对照组作为阴性样本，绘制ROC曲线，结果显示，外周血miR-200a、miR-451a水平用于诊断HBV-ACLF的AUC分别为0.832、0.777，将miR-200a、miR-451a经Logistic回归模型拟合生成联合预测因子，列出联合预测因子取不同值时对应的灵敏度、特异度和预测准确率，取约登指数为最大值时联合预测因子所对应的数值作为最佳截断值，AUC为0.925，较各检测指标单独诊断的效能更高。见表4、图1。

表4 外周血miR-200a、miR-451a水平单独及联合诊断对HBV-ACLF的诊断效能

图1 外周血miR-200a、miR-451a水平用于HBV-ACLF诊断的ROC曲线

2.5不同预后的HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平比较 HBV-ACLF患者中，死亡组外周血miR-200a水平高于生存组，miR-451a水平低于生存组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 不同预后HBV-ACLF患者外周血miR-200a、miR-451a水平比较

2.6外周血miR-200a、miR-451a水平与HBV-ACLF患者预后的关系 以预后情况为因变量(生存=0，病死=1)，外周血miR-200a、miR-451a水平作为自变量(以ROC曲线获得的截断值为界：≤截断值=1，>截断值=2)，经Logistic回归分析，外周血miR-200a、miR-451a水平均为HBV-ACLF患者死亡的独立影响因素(P<0.05)，miR-200a水平越高、miR-451a越低，患者死亡风险越大(P<0.05)。见表6。

表6 外周血miR-200a、miR-451a水平与HBV-ACLF患者预后的关系

3 讨 论

HBV作为一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内，损伤肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死，纤维化[13]。在我国，HBV是引起肝衰竭的重要原因之一。HBV-ACLF主要发生于既往存在HBV感染患者，当其受感染、劳累等因素影响时，急剧发生严重肝功能不全，发病急骤，病情进展迅速，病死率高达50%以上[14-15]。因此，及早诊断HBV-ACLF尤为关键。

miRNA是一类具有调节基因转录与翻译等重要功能的内源性非编码单链RNA，通过与目标信使RNA特异性结合，降解靶RNA或抑制靶RNA翻译，或在特定条件下上调靶基因转录与翻译水平，从而在转录后水平上调控基因表达[16-17]。miRNA参与调控机体多种生物学过程，单个miRNA可参与多个信号通路的调节，而同一个信号通路也可受多种miRNA调节，由此构成一个复杂的miRNA信号调节系统。miRNA异常表达与人类癌症、病毒感染、炎症及心血管疾病等多种疾病发生与发展有关。miR-200a、miR-451a不仅在CHB诊断中具有重要意义，在肝脏的生理代谢及肝病致病机制中也被广泛研究。

以往研究显示，miR-200a在肝癌患者中异常表达，参与了肝癌发生，对肝癌诊断具有一定价值[18]。有学者通过微阵列分析技术，筛选出许多miRNA，发现在HBV-ACLF患者中有9种miRNA表达上调，包括miR-200a[19]。本研究中，观察组外周血miR-200a水平明显高于对照组(P<0.05)，与上述结果一致，且ROC曲线显示，其诊断HBV-ACLF的AUC为0.832，具有一定诊断效能，提示HBV-ACLF患者血液中存在miR-200a高水平，临床可通过检测其水平为疾病诊断提供参考，说明miR-200a不仅是一个体现肝脂肪变性的阶段性标志物，同时也是肝细胞损伤的预测因子。进一步研究显示，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平与肝功能指标ALT、AST、TBIL水平呈正相关(P<0.05)，且30 d病死患者外周血miR-200a水平高于生存患者(P<0.05)，提示随HBV-ACLF患者病情发展，肝细胞损伤加重，外周血miR-200a水平明显上调，miR-200a可预测患者预后。

一项CHB患者miRNA诊断标志物及其与HBV复制的相关性研究中发现，相较于健康人，CHB患者血液中miR-451a水平明显下降，选择miR-451a进行ROC曲线分析，AUC达到0.882，特异度及灵敏度均在80%以上，具有一定诊断价值[20]。另有研究指出，miR-451a可通过结合3′UTR抑制肝脏中致癌因子水平，同时还可抑制肝癌细胞迁移，是优良的抑癌miRNA，在肝癌治疗中具有潜在应用价值[21]。本研究对比分析了CHB患者与HBV-ACLF患者miR-451a水平，发现后者外周血miR-451a水平明显下调，分析原因，可能是由于miR-451a通过影响肝细胞膜相关细胞因子水平，进而缓解肝脏纤维化，防止肝衰竭。此外，本研究结果发现miR-451a可用于诊断HBV-ACLF，且其水平与患者肝功能指标呈负相关(P<0.05)，是患者1个月短期预后的独立影响因素(P<0.05)，提示miR-451a在HBV-ACLF发生、病情演变过程中发挥重要作用。此外，本研究中miR-200a、miR-451a联合诊断HBV-ACLF的AUC为0.925，较单个指标诊断的效能明显提高，因此，建议临床可同时检测二者水平。

综上所述，HBV-ACLF患者外周血miR-200a水平上调，miR-451a水平下调，且二者水平与肝功能及预后有关，可为临床诊断及预后评估提供参考。