复方地黄颗粒对帕金森病阴虚动风证小鼠血清环核苷酸的调节及多巴胺能神经元的修复作用

何竹青，王利，王滢迪，郇鹏飞，杨玉芳，何建成

(上海中医药大学，上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大神经退行性疾病，属于中医“颤证”的范畴[1-2]。 根据本课题组前期研究发现，阴虚动风证是临床最常见的证型[3-4]。 PD 根本病机为脏腑失调，以肝肾阴虚为主，“瘀”“痰”“毒”互结为要，为虚实夹杂之疾。复方地黄颗粒便是基于以上理论研制并经临床反复验证，是治疗阴虚动风证帕金森病取得良好效果的中药复方。 动物实验发现本方通过多途径、多靶点、多环节发挥作用，其机制具体体现在抗氧化应激[5]，抗细胞凋亡[6]，提高自噬水平[7]等方面。 本研究将从对血清环核苷酸的调节及损伤的多巴胺能神经元修复作用两方面，进一步探讨CDG 发挥作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24 只 SPF 级 C57BL/6 雄性健康小鼠，7 ～ 8 周龄，体重20 ～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司【SCXK(沪)2017-0005】，实验动物饲养及观察于上海中医药大学实验动物中心进行【SYXK(沪)2020-0009】。 小鼠适应性喂养 1 周，自由进食、饮水。 饲养环境:室温(23 ± 2)℃，相对湿度(55 ±10)%，光照、黑夜12 h 循环。 本实验动物饲养及操作皆符合上海中医药大学实验动物伦理委员会的相关审批(PZSHUTCM200717037)。

1.1.2 主要试剂与仪器

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(Sigma，M0896-100MG)；cAMP、cGMP 试剂盒(上海威奥生物科技有限公司，EM3362S/EM3363S)；TH(Sigma，sc-25269 AC)；Beta Actin(Proteintech，20536-1-AP)。

病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016)；体视显微镜(中国麦克奥迪公司，型号MoticSMZ-171)； 多 功 能 酶 标 仪 (美 国 BioTek，Synergy 2)；近红外双色荧光成像系统(美国LI-COR公司，OdysscyCLx)。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法

24 只C57BL/6 小鼠适应性喂养1 周后，采用随机数字表将24 只小鼠，随机分成正常组(Normal)、模型组(MPTP+NS)、治疗组(MPTP+CDG)。 16 只小鼠采用MPTP 腹腔注射法制备阴虚动风证PD 模型，MPTP 溶于无菌生理盐水中，按30 mg/kg 剂量腹腔注射，每日1 次，连续5 d；设正常组8 只，腹腔注射相同体积的生理盐水。

2.2 两组患者血浆E2、CRP、Lp-a及FIB水平比较 冠心病组较对照组E2水平明显降低(P<0.05)，而CRP、Lp-a及FIB水平均升高且差异有统计学意义。见表2。

造模成功标准:在帕金森病造模成功的基础上兼有阴虚症状[8-10]:(1)病理上出现多巴胺神经元的丢失；(2)小鼠出现运动迟缓、震颤、僵直等神经行为学症状；(3)小鼠出现毛发干枯，舌象红，小便量少色黄，大便干燥等症状。

1.2.2 复方地黄颗粒制备及给药

复方地黄颗粒(Compound Dihuang Granule，CDG)，由熟地黄，白芍，钩藤，珍珠母，丹参，石菖蒲，全蝎组成，由国家中药工程技术研究中心制备。

小鼠每日用量:参考《定量药理学》(孙瑞元.《定量药理学》北京:人民卫生出版社，1987 ∶247)计算。 小鼠每日用量=标准体重成人每日用量× 1/388。

治疗组小鼠造模后按10 g/kg 剂量给予复方地黄颗粒灌胃，其它小鼠给予同等剂量的生理盐水灌胃，每日 1 次，给药 1 周。

1.2.3 行为学检测

旷场实验(open field test):旷场实验在30 cm ×30 cm 的旷场中进行。 实验前小鼠先适应环境1 h，开始时将小鼠放于旷场中心，摄像头记录小鼠运动情况5 min。 实验后得到实时录像，分析其距离中心点的运动距离及中心区域的停留时间。

爬杆实验(pole test):将小鼠头朝上置于杆上，训练小鼠学会掉头以及爬完全杆路程，每只小鼠训练3 次，每次间隔1 h。 记录各组小鼠治疗后掉头时间以及爬完全程所用时间，每只小鼠测试3 次，取平均值为最终结果。

各组小鼠造模前连续3 d 进行行为学训练，治疗结束后对其进行行为学检测。

1.2.4 微舌象采集

运用 MoticSMZ-171 体视显微镜，Motic Images Plus 3.0(×64)软件，治疗结束后，在同一光源下进行小鼠舌苔的拍摄。 将所拍摄照片输入电脑，采用Adobe Photoshop.2020.图像软件。 图像舌面从舌尖到舌根均等分为5 等份，取中间1/5 的面积作为舌象的量化分析域[11]，读取 R1、G1、B1[12](分别代表红、蓝、绿三种基本颜色)数值，分别进行红色度R的计算:R=R1/(R1+G1+B1)、绿色度G 计算:G=G1/(R1+G1+B1)和蓝色度B 的计算:B=B1/(R1+G1+B1)。

1.2.5 环核苷酸含量检测

各组小鼠取血，静置2 h 后，-4℃状态下离心(3000 rpm，10 min)，取上清液-80℃冰箱保存待测。ELISA 法检测各组小鼠中环核苷酸，环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophos-phate，cAMP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量，并计算cAMP/cGMP 值。

1.2.6 多巴胺能神经元损伤评估

小鼠纹状体装离心管放液氮中，-80℃冰箱保存，Western Blot 法检测小鼠纹状体中酪氨羟化酶(TH)蛋白表达水平。 灌流后取小鼠全脑，放入4%多聚甲醛固定，分别经20%蔗糖、30%蔗糖脱水后冰冻切片机切片，取小鼠黑质层面进行免疫组化(immunohistochemistry，IHC)法检测阳性TH+多巴胺能神经元细胞。

1.3 统计学分析

运用GraphPad Prism 8 软件统计，实验数据以平均值 ± 标准差()表示。 多组数据采用单因素方差分析(One-way analysis of variance，One-way ANOVA)，或双因素方差分析(Two-way analysis of variance，Two-way ANOVA)，P＜ 0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠行为学检测

小鼠的运动轨迹显示，与正常组相比，模型组小鼠运动距离减少，中心区域停留时间增加，经治疗后，运动、探索能力得到改善，差异具有显著性(P＜0.001)。 模型组小鼠的反应力较正常组减弱，运动迟缓，具体表现在转头时间、爬杆时间明显增加，经过治疗后运动能力改善(P＜0.001)(见图1)。

图1 各组小鼠行为学检测Note. A. Trajectory map of mice. B. Open field test. C. Pole test. Compared with the normal group，※※※P ＜ 0.001. Compared with the model group，***P ＜ 0.001.(The same in the following figures)Figure 1 Behavioral test of mice in each group

2.2 小鼠微舌象及舌色度值分析

经舌色度值分析发现，与正常组小鼠相比，模型组小鼠舌色红色度值比例明显升高，绿色度值比值G、蓝色度比值 B 明显低于正常组小鼠(P＜0.01)。 与模型组相比，治疗组小鼠舌色红色度值比例明显降低，绿色度值比值G、蓝色度比值B 升高(P＜ 0.01)(见图2)。

图2 小鼠微舌象及舌色度值分析结果Note. Compared with the model group，**P ＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Analysis of microscopic tongue image and chromaticity value of tongue color in mice

2.3 环核苷酸(cAMP、cGMP)表达

与正常组相比，模型组小鼠血清中cAMP 明显升高(P＜ 0.001)，而 cGMP 显著下降(P＜ 0.001)，且模型组cAMP/cGMP 比值明显高于正常组(P＜0.001)。 经过治疗后，cAMP 下降，cGMP 升高，其比值较模型组明显降低(P＜0.05)(见图3)。

图3 环核苷酸表达及比值Note. Compared with the model group，*P ＜ 0.05.(The same in the following figures)Figure 3 cAMP、cGMP expression and ratio

2.4 多巴胺能神经元损伤评估

IHC 显示，与正常组相比，模型组小鼠黑质致密部TH+阳性多巴胺神经元细胞数量减少(P＜0. 001)，经治疗后，其含量显著增加(P＜0. 01，n= 3)。 模型组小鼠纹状体内 TH 蛋白表达明显低于正常组，治疗后含量增加(P＜0. 01，n= 3)(见图4)。

图4 酪氨酸羟化酶表达Note. A. Expression of TH in SNpc. B. Expression of TH in striatum. Compared with the normal group，※P ＜ 0.05.Figure 4 Expression of TH

3 讨论

PD 是第二大神经退行性疾病，病因多样，发病机制复杂[13]，中医将其归属于“颤证”范畴。 西药短期内对改善PD 症状有效，但长期使用副作用较多，不能缓解患者病情，严重影响了其临床运用的顺从性。 中医治疗PD 强调辨证论治，早期中医药的干预可扼发病之势[14]，中晚期协同西药增效减毒，避免、缓解并发症状[15-16]。 何建成教授认为，“虚”“瘀”“痰”“毒”贯穿 PD 发病总过程，肝肾阴虚，脏腑功能失调为本，肝风、痰浊、瘀热、毒聚络损为实[17]。 何建成教授研制的复方地黄颗粒(CDG)具有补肾养肝，息风止颤，化痰活血，通络解毒之功。 临床运用CDG 能改善PD 患者症状，联合西药美多芭“增效减毒”，对PD 患者有一定的神经保护作用[18]。

病证结合动物模型是现阶段中医药基础研究的重要载体[19]。 神经毒素 MPTP 制备 PD 小鼠动物模型是目前研究者常用的建模方法[20]。 MPTP能通过血脑屏障，生成代谢产物MPP+，抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，导致氧化应激和ATP 生成的减少，造成多巴胺能神经元死亡[21]。 课题组前期运用MPTP 腹腔注射制备PD 阴虚动风证小鼠模型[10]。 本实验进一步从小鼠的病因、行为学、舌象等对该模型进行验证，在此基础上探讨CDG 治疗PD 阴虚动风证小鼠的作用机理。 结果显示:造模后小鼠病理显示多巴胺能神经元丢失，同时具备PD阴虚证的典型症状。 如造模后小鼠TH 表达减少，出现颤动、运动迟缓、抓握能力较差、便秘、毛色干枯、舌红、小便量少、大便干燥等症状。 给予CDG 治疗后，小鼠舌红色度值明显降低(P＜0.01)，运动综合能力得到显著改善(P＜0.001)，TH 表达增加(P＜0.01)。 这说明CDG 在一定程度上能改善小鼠阴虚症状，减轻小鼠多巴胺神经元的损伤。

环核苷酸(cAMP、cGMP)可调节细胞功能，与机体神经内分泌系统的功能密切相关[22]。 本研究对小鼠血清中环核苷酸测定，发现模型组小鼠血清中cAMP 明显升高，cGMP 显著下降。 已有的研究表明，cAMP、cGMP 两者作用常具有拮抗性，类似于中医阴阳相互制约的关系，多数的研究将其作为判断中医阴虚、阳虚证候的关键指标之一[23-24]。 本研究中 cAMP/cGMP 比值明显高于正常组(P＜0.001)，提示本模型具有阴虚特性。 给予CDG 干预之后，血清cAMP 明显下降，cGMP 升高，两者比值降低(P＜0.001)。 提示CDG 可能通过调节血清环核苷酸(cAMP、cGMP)含量改善小鼠阴虚的症状。

PD 发生的根本原因在于黑质中多巴胺能神经元的变性缺失[25]。 TH 为多巴胺合成的限速酶，MPTP 在体内形成的代谢产物能抑制TH 的活性降低多巴胺含量[26]，因此，TH 含量在一定程度上反映了多巴胺神经元的数量[27]。 本研究分别用IHC、Western Blot 法检测小鼠黑质、纹状体中TH 含量，结果显示，模型组小鼠黑质中阳性TH+多巴胺能神经元细胞数量减少，纹状体内TH 蛋白水平表达降低(P＜0.01)，治疗后，两者表达皆明显增加(P＜0.01)，这表明CDG 能修复PD 阴虚动风证小鼠损伤的多巴胺能神经元。

综上，本研究进一步从PD 小鼠病因、症状、客观指标检测、以方测证等方面验证该模型的中医证候属性，本模型可靠、稳定。 复方地黄颗粒，方以补肾养肝为主，祛痰、化瘀、解毒为辅，其治疗切中帕金森病的根本病机。 本研究证实复方地黄颗粒治疗PD 阴虚动风证小鼠疗效显著，能调节血清中环核苷酸含量，有效修复损伤的多巴胺神经元。