决明子色素提取工艺优化及稳定性与抗氧化性研究

刘维兵 蒙富声 杨松涛 李彦荣 张慎孝 杨 林 包晓玮*

1.青岛德慧海洋生物科技有限公司 山东青岛 266000

2.新疆农业大学食品科学与药学学院 新疆乌鲁木齐 830000

3.正大农业科技(浙江)有限公司 浙江慈溪 315300

决明子(Catsia tora Linn)，别称为草决明、马蹄决明等，豆科决明属植物。

决明子具有清肝明目，润肠通便，并具有一定降血压，降血脂作用，决明子中存在大黄酚、橙黄决明素等具有抑菌谱较为广泛，将决明子中黄色素(天然植物色素)进行提取，作为食品着色剂也被人们普遍认可[1，2]，超声辅助提取是利用超声波具有的穿透能力[3，4]，较强的剪切力使植物细胞膜快速破裂，其细胞内的分子化合物，能快速的与提取溶剂相结合，并缩短提取时间，增加黄色素的提取率，但传统的植物色素稳定性较差，在强光照射下极易被分解，且在较高的温度下也会造成植物色素的降解[5，6]。

本试验采用超声辅助法提取决明子色素，应用单因素试验方法观察不同试验条件对色素提取率的影响，并通过正交试验法对提取工艺进行分析与优化。并将提取出的决明子色素进行保护，通过单因素结合正交试验法，选取最佳的保护工艺。

通过对比试验证明经保护后的决明子色素具有较高的稳定性，且具有较强的抗氧氧化活性。为后续决明子色素的进一步开发和使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

决明子，青岛德慧海洋生物科技有限公司;

1，1-二苯基-2-三硝基苯(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2，2’-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)，美国Sigma公司；

维生素C、维生素E，天津市致远化学试剂有限公司；

乙醇等其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

闭路喷雾干燥机，CPSD-5，常州志恒责任有限公司；

粉碎机，XL-02A，烨昌机械有限公司；

超声波处理机，JBT/C-YCL400T/3P(D)，济宁金佰特工程机械有限公司；

旋转蒸发仪，RE-52B，上海亚荣生化仪器厂；

电动离心机，80-1，金坛市恒丰仪器厂；

紫外分光光度计，UV-2550，岛津试验器材有限公司。

1.3 方法

将决明子种子磨碎，利用粉碎机负压将质量较轻的胚芽粉收集起来，备用。

1.3.1 设计决明子色素提取单因素试验

1.3.1.1 乙醇浓度对提取决明子色素影响

准确称取100g决明子胚芽粉，根据前人研究准确控制超声时间为30min，超声功率为120W,料液比为1∶30，设置乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%，提取结束后4 000r离心取上层清液，检测其在324nm处的吸光值，平行测定3次[7，8]。

1.3.1.2 超声时间对提取决明子色素影响

准确称取100g决明子胚芽粉，根据前人研究准确控制超声功率为120W,料液比为1∶30，乙醇浓度为50%，设置超声时间为10、20、30、40、50min，提取结束后4 000r离心取上层清液，检测其在324nm处的吸光值，平行测定3次。

1.3.1.3 超声功率对提取决明子色素影响

准确称取100g决明子胚芽粉，根据前人研究准确控制超声时间为30min，料液比为1∶30，乙醇浓度为50%，设置超声功率为60、80、100、120、140W，提取结束后4 000r离心取上层清液，检测其在324nm处的吸光值，平行测定3次。

1.3.1.4 料液比对提取决明子色素影响

准确称取100g决明子胚芽粉，根据前人研究准确控制超声时间为30min，乙醇浓度为50%，超声功率为120W，设置料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取结束后4 000r离心取上层清液，检测其在324nm处的吸光值，平行测定3次。

1.3.2 设计决明子色素提取正交试验

根据单因素试验结果，影响决明子色素提取含量的主要因素有：乙醇浓度、超声时间、超声功率、料液比。故以此四因素设计L9(34)正交试验，以提取物中在324nm处的吸光值为评价指标，确定提取的最佳工艺条件(见表1)。

1.3.3 决明子稳定性及抗氧化性单因素试验

1.3.3.1 α-氨基酸添加量对决明子色素稳定性及抗氧化性的影响

经上述方法提取出的决明子色素，根据前人研究，控制柠檬酸添加量为质量比的1%，维生素C、维生素E的添加量各为质量比的3%，β-环糊精与麦芽糊精的配比为3∶1，质量比为20%，设置α-氨基酸的添加量各为质量比的1%、3%、5%、7%、9%，喷雾干燥后取1g决明子色素粉，溶于100mL蒸馏水中，进行决明子色素粉的稳定性试验及抗氧化试验测定，平行测定3次[9,10]。

1.3.3.2 柠檬酸添加量对决明子色素稳定性及抗氧化性的影响

经上述方法提取出的决明子色素，根据前人研究，控制维生素C、维生素E的添加量各为质量比的3%，β-环糊精与麦芽糊精的配比为3∶1，质量比为20%，α-氨基酸的添加量各为质量比的5%，设置柠檬酸添加量为1%、2%、3%、4%、5%，喷雾干燥后进行决明子色素粉的稳定性试验及抗氧化试验测定，平行测定3次。

1.3.3.3 维生素添加量对决明子色素稳定性及抗氧化性的影响

经上述方法提取出的决明子色素，根据前人研究，控制β-环糊精与麦芽糊精的配比为3∶1，质量比为20%，α-氨基酸的添加量各为质量比的5%，柠檬酸添加量为2%，设置维生素的添加量各为质量比的1%、2%、3%、4%、5%，喷雾干燥后进行决明子色素粉的稳定性试验及抗氧化试验测定，平行测定3次。

1.3.3.4 β-环糊精与麦芽糊精的配比对决明子色素稳定性及抗氧化性的影响

经上述方法提取出的决明子色素，根据前人研究，控制α-氨基酸的添加量各为质量比的5%，柠檬酸添加量为2%，维生素的添加量各为质量比的3%，设置β-环糊精与麦芽糊精的配比分别为1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1，添加量为质量比的20%，喷雾干燥后进行决明子色素粉的稳定性试验及抗氧化试验测定，平行测定3次。

1.3.4 设计决明子色素保护正交试验

根据单因素试验结果，影响决明子色素稳定性及抗氧化性的主要因素有:α-氨基酸添加量、柠檬酸添加量、维生素添加量、β-环糊精与麦芽糊精配比。故以此4因素设计L9(34)正交试验，以决明子色素的耐100℃高温试验、及对DPPH自由基的清除率为评价指标，确定最佳保护工艺条件(见表2)。

表2 因素及水平表Table 2 Factor levels design table

1.3.5 决明子色素稳定性试验

1.3.5.1 光照实验

取保护前、后决明子色素粉各1g，分别溶于100mL蒸馏水中，将决明子色素粉溶液分别置于阳光下，与室内避光的橱窗里，隔8h分别测定决明子色素溶液在324nm处的吸收波长[11,12]。

1.3.5.2 耐高温实验

取保护前、后决明子色素粉各1g，分别溶于100mL蒸馏水中，将决明子色素溶液置于100℃的恒温水浴锅中，恒温2h后测定决明子色素溶液在324nm处的吸收波长[13,14]。

1.3.6 体外抗氧化活性评价

1.3.6.1 对DPPH自由基清除能力的测定

参考艾拉旦·麦麦提艾力等[15]方法稍作修改，用无水乙醇配制成0.2mmol/L的DPPH工作液(现配现用)。取1mL样品，浓度为1.0mg/mL，向样品中加入2mL DPPH溶液(0.2mmol/L)，振荡摇匀并在室温下黑暗中反应30min(避光)，测定517nm处吸光度值，采用同浓度的Vc溶液做阳性比较。按公式(1)计算清除率：

(1)

式中：

Ai为1mL样品(Vc)与2mL DPPH溶液的吸光度；

Aj为1mL样品(Vc)与2mL无水乙醇的吸光度；

A0为1mL蒸馏水与2mL DPPH的吸光度。

1.3.6.2 对ABTS自由基清除能力的测定

根据Wang[16](2012)等的方法稍作修改。配置1.0mg/mL浓度的样品溶液1mL，将4mL ABTS工作液加入试管中，充分混合均匀，室温暗处反应6min，于734 nm处测定吸光度，以相同浓度的Vc溶液为阳性对照，按公式(2)计算其清除率：

(2)

式中：

Ai为1mL样品(Vc)与4mL ABTS的吸光度；

Aj为1mL样品(Vc)与4 mL蒸馏水的吸光度；

A0为1mL蒸馏水与4mL ABTS溶液的吸光度。

1.3.7 数据处理

每次试验均进行3次重复操作，所有试验数据采用SPSS 16.0统计软件对结果进行显著性分析，处理结果均以X±SD表示，图表制作利用Excel 2003软件。

2 结果与分析

2.1 决明子色素提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对决明子色素提取率的影响

由图1可知：乙醇浓度为50%时，在324nm处吸光值达到最大，随着乙醇浓度的不断增加，最大吸收波长下的吸光值会逐渐降低，低浓度的乙醇提取的决明子色素，也显著低于50%乙醇作为溶剂提取出的决明子色素吸光值。

图1 乙醇浓度对决明子色素提取率的影响Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.2 超声时间对决明子色素提取率的影响

由图2可知：决明子色素在10～30min之间提取的提取率在逐步升高，在30min时达到峰值，超过30min以后决明子色素的提取率会随着时间的延长而降低。

图2 超声时间对决明子色素提取率的影响Fig. 2 Effect of ultrasonic time on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.3 超声功率对决明子色素提取率的影响

由图3可知：决明子色素的提取率在60～120W时随着超声功率的增加而升高，在120W时达到了峰值，到达峰值后再升高功率，决明子色素的提取率则出现下降趋势。

图3 超声功率对决明子色素提取率的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of pigment from Semen Cassiae

2.1.4 料液比对决明子色素提取率的影响

由图4可知：随着料液比的逐渐升高，决明子色素的提取率逐渐呈下降趋势，在料液比为1∶10～1∶20时，对决明子色素的提取率影响，差异不显著(p>0.05)，但当料液比大于1∶20以后决明子色素提取率会逐渐降低且差异显著(p<0.05)。

图4 料液比对决明子色素提取率的影响Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Cassia Seed Pigment

2.2 决明子色素提取率正交试验结果

2.2.1 最佳工艺参数的确定

决明子色素提取正交试验设计与结果见表3。

通过对表3试验极差值分析可知，影响决明子色素提取的因素主次分别为，乙醇浓度>料液比=超声时间>超声功率；综合对因素A、B、C、D进行分析，在A2B3C1D2工艺参数下，得到的决明子色素最大吸光值为1.266Abs，因此最佳提取工艺为乙醇浓度为50%，料液比为1∶20，超声时间为40min，超声功率为100W。

表3 L9(34)决明子色素提取正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results of L9(34)Cassia Seed Pigment Extraction

2.3 影响决明子色素稳定性、抗氧化性单因素试验结果

2.3.1 α-氨基酸添加量对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响

由图5可知：随着α-氨基酸添加量的增加，决明子色素的耐热能力也在不断增大，同样对DPPH的清除能力也随着α-氨基酸添加量的增加，而不断增加，呈现出正相关趋势，但当α-氨基酸添加量达到5%时，随着添加量的不断增大，其耐热能力及对自由基清除能力不再随α-氨基酸添加量的增大而增长。

图5 α-氨基酸添加量对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响Fig. 5 Effect of material liquid ratio on extraction rate of Cassia Seed Pigment

2.3.2 柠檬酸添加量对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响

由图6可知：随柠檬酸添加量的增加，决明子色素的耐热能力及对自由及清除能力也随之增加，但当柠檬酸添加量为2%，出现拐点，随柠檬酸添加量不断增大，其耐热能力及对自由及清除能力基本保持不变。

图6 柠檬酸添加量对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响Fig. 6 Effect of citric acid addition on the stability and antioxidant activity of Cassia Seed Pigment

2.3.3 维生素添加量对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响

由图7可知：随着维生素添加量的不断增加，决明子色素的耐热能力也在不断增大，同样对DPPH的清除能力也随着维生素添加量的增加而不断增加，呈现出正相关趋势，但当维生素添加量达到3%时，随着添加量的不断增大，其耐热能力及对自由基清除能力不再随维生素添加量的增大而增长。

2.3.4 β-环糊精与麦芽糊精配比对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响

由图8可知：在环糊精与麦芽糊精的配比中，随环糊精所占比重的加大，决明子色素的耐热能力及对自由基清除能力也随之增加，但当环糊精与麦芽糊精配比为3∶1时，其耐热能力达到顶峰，随环糊精所占比重的不断增大，其耐热能力基本保持不变。

图8 β-环糊精与麦芽糊精配比对决明子色素稳定性、抗氧化性的影响Fig. 8 β- Effects of the ratio of cyclodextrin and maltodextrin on the stability and antioxidant activity of jumingzi pigment

2.4 保护决明子色素正交试验结果

决明子色素稳定性、抗氧化性正交试验设计与结果见表4。

由表4分析结果：通过稳定性试验极差值可以看出，影响决明子色素稳定性因素主次为β-环糊精与麦芽糊精配比>α-氨基酸添加量>柠檬酸添加量>维生素添加量；通过抗氧化性试验极差值可以看出，影响决明子色素抗氧化性因素主次为维生素添加量>柠檬酸添加量>β-环糊精与麦芽糊精配比>α-氨基酸添加量；综合对因素A、B、C、D进行分析，在A2B1C2D3工艺参数下，得到的决明子色素不仅有较强的耐高温能力，而且具有较强的抗氧化能力。因此选择A2B1C2D3为最佳提取工艺，α-氨基酸添加量5%，柠檬酸添加量1%，维生素添加量3%，β-环糊精与麦芽糊精的配比为3∶1。

表4 L9(34)决明子色素稳定性、抗氧化性正交试验设计与结果Table 4 Orthogonal design and results of L9(34) Cassia Seed Pigment stability and antioxidation

2.5 决明子色素保护前、后对DPPH、ABTS自由基的清除能力对比

DPPH自由基，是一种较为稳定的自由基，其获得稳定的氮自由基，是由于存在多个吸电子基团，该自由基最大的吸收峰为517nm，可以成为抗氧化能力检测较为优异的选择[17]。

ABTS自由基的特征吸收峰通常选择在734nm，通常用该波长来检测吸光度的改变[18]。ABTS法是判断还原物质清除自由基能力较为常见的方法之一，因为ABTS具有还原性，容易被氧化成较为ABTS+自由基，这种自由基是一种较为稳定的蓝绿色自由基[19]。其褪色是与抗氧化物质相结合[20]。褪色程度越强，吸光度越低，抗氧化能力可通过吸光度值大小判断[21]。

由图9可以看出：决明子色素在未经保护处理，喷雾干燥得到决明子色素粉，其清除自由基能力较差；但经处理保护后的决明子色素粉，具有较强的清除自由基能力，在体外具有较高的抗氧化能力，经保护后的决明子色素粉，相较于未经保护的决明子色素粉其对DPPH自由基的清除能力提升1.56倍，对ABTS自由基的清除能力提升1.88倍，差异显著(p<0.01)。

图9 决明子色素保护前、后对DPPH、ABTS自由基的清除能力对比Fig. 9 Scavenging ability of Cistanche deserticola polysaccharide on DPPH,ABTS free radical

2.6 决明子色素保护前、后稳定性能力对比

2.6.1 决明子色素保护前、后耐光能力比对

如图10所示：决明子色素粉在未作保护前，其耐光、耐热能力较差；而经保护后其耐光、耐热能力分别增加了2.63倍、3.28倍，差异显著(p<0.01)。

图10 决明子色素保护前、后耐光、耐热能力对比Fig. 10 comparison of light resistance and heat resistance of cassia seed before and after pigment protection

3 结论

本试验以决明子胚芽粉为原料，经不同工艺提取，最终证明不同的提取工艺色素提取率差异显著，最终选择最佳提取工艺为：超声时间40min、料液比1∶20、乙醇浓度50%、超声功率100W；未经保护喷雾干燥出的决明子色素粉，其耐光耐热性较差，而经保护后喷雾干燥出的决明子色素粉，其耐光耐热能力分别提高了2.63倍、3.28倍。

综上所述，经保护的决明子色素不仅在体外具有良好的抵御氧化作用能力，而且解决了传统决明子色素不耐高温，强光下分解的弊端，为决明子色素的开发利用提供了相应的理论依据。