抗栓胶囊中9 种重金属有害元素的含量测定及风险评估*

薛 平，陈雨蕉，胡金云，李 莉

常州市食品药品纤维质量监督检验中心，常州213000

抗栓胶囊具有活血化瘀、抗栓通脉之功效；多用于血栓闭塞性脉管炎瘀血阻络证。其由当归尾、水蛭、土鳖虫、丹参、乌梢蛇、麝香、马钱子、骨碎补、僵蚕、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味药材制成，对脑血栓、心肌梗塞、血栓性静脉炎等有较好的辅助治疗效果[1]。

目前抗栓胶囊质量控制研究主要集中于丹参酮ⅡA等成分的含量测定，针对土鳖虫进行的黄曲霉毒素限量安全控制，其他方面的质量控制研究较少[2]。目前中药外源性有害物质的安全性监控是中药质量控制重点之一，外源性有害物质主要包括重金属及有害元素、农药残留和真菌毒素等[3]。作为生粉直接入药的抗栓胶囊，可能存在一定程度的重金属及有害元素安全风险。本研究采用电感耦合等离子体质谱法测定抗栓胶囊中9 种重金属有害元素V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 的含量[3，4]，考察不同生产企业的抗栓胶囊中重金属有害元素概况，为该药的质量控制和安全性评价提供参考。

1 材 料

1.1 仪器

电感耦合等离子质谱仪（ICP Q，美国赛默飞世尔科技有限公司）；微波消解仪（CEM mars 5 express 美国培安有限公司）；XP105DU 万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药与样品

9 种单元素标准溶液：钒（V，批号20041435）、钴（Co，批号20041435），镍（Ni，批号20041435）、砷（As，批号20050635）、镉（Cd，批 号20050635）、汞（Hg，批号20050635）、铅（Pb，批号20050635），浓度均为100 μg·mL-1，铜（Cu，批号20082535，浓度1000 μg·mL-1），均购自于钢研纳克检测技术股份公司；铬（Cr，批号B2006161，浓度为100 μg·mL-1）购自于坛墨质检标准物质中心。

内标元素：钪（Sc，批号19090235，浓度100 μg·mL-1），锗（Ge，批号20092745，浓度1000 μg·mL-1），铟（In，批号19092985，浓度100 μg·mL-1），铋（Bi，批号20032635，浓度100 μg·mL-1）均购于钢研纳克检测技术股份公司。

金单元素标准溶液（Au，批号20071635，浓度100 μg·mL-1）购自于钢研纳克检测技术股份公司；65%硝酸为优级纯；水为去离子水。

抗栓胶囊样品涵盖全国20 个省级行政区，共涉及9 家生产企业（编号A-I），共29 批次样品。

2 方法[5，6]

2.1 ICP-MS 仪器测定方法

射频功率：1550 W；蠕动泵：40 r·min-1；冷却气流量：14 L·min-1；载气补偿气流速：0.8 L·min-1；雾化气流量：0.9021 L·min-1；雾化室温度：2.7 ℃；碰撞气体：氦；碰撞气流速：4.98 mL·min-1；采样深度：5.00 mm；延迟时间30 s；积分时间5.8 s，扫描次数：15 次。

测定时选取的同位素为51V、52Cr、60Ni、63Cu、75As、114Cd、202Hg、208Pb，其中51V、52Cr 以45Sc 作为内标，60Ni、63Cu、75As 以72Ge 作为内标，114Cd 以115In 作为内标，202Hg、208Pb 以209Bi 作为内标，通过蠕动泵在线加入内标溶液，测定时仪器的内标管始终插入内标溶液中，样品管按要求放入相应的溶液中进行测定，取3 次读数的平均值计算。在仪器的数据分析软件中，将内标法设置为在线内标实时校正，即数据采集点的信号以实时内标点的信号进行校正。各个元素以内标校正的信号值（cps）为纵坐标，相应的质量浓度（ng·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。按仪器数据分析软件的要求，设置相关参数，得到各元素的标准曲线、供试品溶液中各元素的浓度。根据各元素的浓度值计算样品中待测元素的含量。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品贮备液 分别精密量取V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 单元素标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释制成每1 mL 分别含V、Cr、Ni、Co均为5 μg 的溶液；每1 mL 分别含Cu、As、Cd、Hg、Pb 为100、100、1、1、100 μg 的溶液，即得。

2.2.2 内标溶液 分别精密吸取Sc、In、Bi 单元素标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释制成每1 mL 含Sc、In、Bi 各50 ng，含Ge 100 ng 的内标溶液。

2.2.3 供试品溶液 取抗栓胶囊样品内容物约0.3g，精密称定，置于耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5mL，放置过夜，密闭、消解。消解程序为在0～5min，由初始温度升温到120 ℃，维持2 min；在7～13 min，由120 ℃升温到160 ℃，维持3 min；在16～20 min，由160 ℃升温到180 ℃，维持25 min。消解完全后，消解液冷却至60 ℃以下，取出，放冷，将消解液转入50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于聚四氟乙烯量瓶中，加入金单元素溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀释至刻度，摇匀，即得。除不加样品内容物外，同法制备空白溶液，在同样的分析条件下进行空白试验。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品贮备液适量，用2%硝酸溶液稀释制成每1 mL 含V、Co、Cr、Ni 为0、0.1、1、2.5、10、20、50 ng，含Cd、Hg 为0、0.02、0.2、0.5、2、4、10 ng，含As 为0、0.6、6、15、60、120、300 ng，含Cu 为0、1、10、25、100、200、500 ng，含Pb 为0、1、10、25、100、200、500、1000 ng的系列浓度混合对照溶液。

按“2.1”项下的测定条件，依次将仪器的样品管插入各个浓度的标准品溶液中进行测定（浓度依次递增），各个元素以内标校正的信号值（cps）为纵坐标，相应的质量浓度（ng·mL-1）为横坐标，绘制各元素的标准曲线。回归方程与线性范围见表1。

2.3.2 精密度试验 取线性关系中标准曲线第5个浓度点的对照品溶液，按“2.1”项下检测条件测定，测得溶液中各元素的浓度，重复测定6 次。根据测得的浓度值计算8 种元素的RSD 值，均＜5%，表明仪器精密度良好，见表1。

表1 9 种元素的线性、精密度、重复性和检测限（表中元素分类来源于ICH Q3D）

2.3.3 重复性试验 精密称取样品0.3 g（编号A），按上述“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6 份并分析，测得供试品溶液中各元素的浓度，计算得到各元素的含量。根据各元素的含量计算RSD，8 种元素的RSD 值均＜6%，表明本方法重复性良好，见表1。

2.3.4 加样回收率试验 取同一批次样品（编号A）0.3 g，精密称取，置于聚四氟乙烯消解罐内，精密加入混合标准贮备液0.1 mL，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，平行制备6 份，按“2.1”项下检测条件测定供试品溶液中各元素的浓度，计算各元素的含量，扣除样品（编号A）中元素本底的含量，分别计算各元素的回收率、平均回收率及相对标准偏差（RSD%），结果见表2。表明本试验准确度良好。

3 结果

3.1 样品测定结果

取9 企业的抗栓胶囊，按“2.2.3”的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下检测条件测得供试品溶液中各元素浓度，分别计算样品中各元素含量。见表3。

表3 29 批样品中元素的含量测定结果（n=2，mg·kg-1）

3.2 测定结果分析

3.2.1 指纹图谱直观分析 为直观地反映测定结果，绘制了抗栓胶囊有害元素的指纹图谱[7]。将测定的元素按原子序号排列作为横坐标，29 批样品的测定结果为纵坐标，绘制有害元素含量分布曲线。由指纹图谱显示（见图1），样品中有害元素含量存在一定程度的波浪式分布，其中V、Cr、Co、Ni、Cu、Cd、Hg含量相对较低，不同样品间As 和Pb 的量存在显著差异，其余大部分元素量的多寡顺序几乎趋于一致。

图1 抗栓胶囊有害元素指纹图谱

3.2.2 热图直观分析 热图已广泛应用于数据分析，能清晰表现数据的疏密、频数高低和差异变化，从而弥补上述元素指纹图谱分析的不足之处[8]。利用Image GP 网页制图工具将29 批样品的测定结果绘制成热图（见图2）。各元素的含量和每个元素含量的平均值相比，用蓝色向红色表示，越红差异程度越大。图2 结果表明，29 批样品中Pb、Cr、Hg、As 4 种元素的含量存在显著差异性。其中样品中Pb 差异最为显著，颜色呈阶梯式变化。Pb 含量的高低对应颜色的变化过程大致可分为4 个梯度（由低到高）：第一梯度（H＜F2＜F1＜D＜E2＜A＜E1）呈深蓝逐渐变为蓝色；第二梯度（B4＜B10＜B2＜B5＜I2＜B11＜I3＜G3＜B6）由蓝色逐渐变为绿色；第三梯度（C4＜C1＜B3＜B8＜I1）由绿色逐渐变为黄色；第四梯度（G1＜G2＜B7＜C3＜C5＜C2＜B9＜B1）由黄色逐渐变为红色。热图中各元素的颜色差异清晰表现了样品间含量的差异，同时热图中左边企业聚类分析和上面9 种元素之间的聚类分析的情况表明，在29 批样品中，9 种有害元素含量之间无直接明显的相关性，不同企业、同一企业不同批次间未出现明显的聚类现象。

图2 9 种有害元素含量的热图

4 风险评估

4.1 铅、镉、砷、汞、铜的健康风险评估[9，10]

“中药中外源性有害残留物安全风险评估技术指导原则”和《中国药典》2020 年版四部9302“中药有害残留物限量制定指导原则”描述了重金属及有害元素最大限量理论值的计算方法，该值的计算依据源自于危害指数法评估中药中重金属的暴露量。目前该方法常被应用在Pb、Cd、As、Hg、Cu 5 种元素的健康风险评估，其他有害元素由于缺乏公认的健康指导值（A），使用频率较低。

依据《中国药典》2020 年版中相关规定，计算得出该制剂中铅、镉、砷、汞、铜的最大限量理论值。

公式1 中L 为最大限量理论值（mg·kg-1）；A 为每日允许摄入量（μg·kg-1·bw），Pb 为1.3 μg·kg-1，Cd 为0.83 μg·kg-1，As 为3.0 μg·kg-1，Hg 为0.57 μg·kg-1，Cu 为500 μg·kg-1；W为人体平均体重（kg），按63 kg 计；M 为每日人均可服用的最大剂量（kg），抗栓胶囊每日服用量为15～24 粒，每粒约0.3 g，每日最大服用量约为7.2 g（0.007 2 kg）；AT 为平均寿命天数，一般为365 天/年×70 年；EF 为中药服用频率（天/年），EF 为每年90 d；ED 为一生的服用中药的暴露年限，Ed为20 年；t 为中药经煎煮或提取后，重金属元素的转移率（%），中成药t 为100%；10 为安全因子，表示每日由中药材及其制品中摄取的重金属量不大于日总暴露量（包括食物和饮用水）的10%。

Pb、Cd、As、Hg、Cu 的最大限量理论值（mg·kg-1）分别为16.1、10.3、37.3、7.1、6210。

通过试验发现，29 批抗栓胶囊中有19 批Pb 的含量超出最大理论限量值，2 批As 的含量超出最大理论限量值。另外3 种元素的含量均低于各自的最大理论限量值。

由计算结果警示抗栓胶囊中Pb、As 含量可能存在一定程度的风险，应对相关元素进一步明确风险来源，探究该品种的健康风险程度。

4.2 钒、铬、钴、镍的健康风险评估[4]

ICH Q3D 中对元素健康风险评估，规范严谨，通常将30% PDE 值的定义为控制阈值，具有较好的参考作用。ICH Q3D 中V、Cr、Co、Ni 的每日允许暴露量（PDE，μg·d-1）分别为180、19800、90、5400；抗栓胶囊每日最大服用量约为7.2 g。为方便统计，将30% PDE 值按每日最大服用量折算到相应元素的含量（控制阈值含量）。V、Cr、Co、Ni 的控制阈值含量（mg·kg-1）分别为4.2、458.3、2.1、8.3。

在29 批次样品中，仅有一批次样品中V 含量（6.072 mg·kg-1）超过4.2 mg·kg-1，其余3 种元素含量均低于控制阈值含量。ICH Q3D 计算模型严格程度极高，常用于化学药，未充分考虑中国人生活、用药和中成药的实际情况，对中药的评估往往过于严格。综合考虑，相对而言，V 含量过高导致的健康风险概率仍然较低。本试验结果表明，抗栓胶囊中V、Cr、Co、Ni 等4 种有害元素含量的健康风险相对较低。

5 讨论

《中国药典》2020 年版关于重金属有害元素质量控制主要考察Cr、Cu、As、Cd、Hg、Pb；ICH Q3D 一般要求口服制剂考察1 类对人体有害元素和2 类给药途径依赖型的人体有害元素（根据出现的概率分为2A 和2B 亚类），其中2B 亚类出现概率较低。通过预实验，综合考虑，选取药典、ICH Q3D 1 类和2A 亚类所有涉及的9 种重金属有害元素。

预实验发现，取10 粒抗栓胶囊内容物混匀，称取内容物适量，测定有害元素含量，可能导致测定结果重复性较差。考虑到本品处方量大，重金属及有害元素属于痕量检测，可能会出现不均匀的情况。合理取样对痕量检测结果的准确性至关重要。预实验对比了取同一批本品内容物10、25、50、80 g，发现取样50 g 与80 g 试验结果重复性良好。故正式测定时以四分法取样，每份内容物取样量不＜50 g。

6 小 结

重金属及有害元素是中药外源性有害物质量控制的重点之一。以风险评估模型科学识别风险是目前进行中药质量健康评价的主要方法。本研究考察了29 批抗栓胶囊中9 种重金属有害元素大致概况，发现样品中Pb 含量差异显著，部分样品Pb 含量较高，As 有2 批含量异常，这提示可能与企业所用原料有关，也可能与生产工艺、生产过程中清场不彻底造成了交叉污染有关。对抗栓胶囊铅、砷含量较高的真正原因，有待进一步研究，以保证用药安全。