STAT3通路调控阿尔兹海默症大脑脂质代谢及星形胶质细胞活化的机制研究

2022-07-15罗媛肖川林伟杰

岭南急诊医学杂志 2022年3期

罗媛肖川林伟杰

阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种常见于65 岁以上老年人的神经退行性疾病。其主要的特征是认知功能在多个领域呈现出渐进性损伤，包括记忆、语言、情感、行动能力等，并伴随有淡漠、行为缺陷。中国已逐渐步入老龄化社会，预计到2050 年我国AD 患者人数将超过4000万人，为社会和家庭带来了沉重负担［1］。

根据《柳叶刀》痴呆症预防、干预和护理委员会的数据显示，在至少10 年随访中，发现中年（小于65 岁）的低密度脂蛋白胆固醇水平与患痴呆风险呈现中度相关，为痴呆症可控危险因素［2］。患者大脑显示胆固醇生物合成和周转减少，海马CA3⁃CA2 层椎体神经元胆固醇水平升高［3］。中枢神经系统中，星形胶质细胞在维持CNS 电解质平衡、神经介质摄取、神经元的发育及受损后的修复等方面起重要作用。研究发现，成人大脑中主要的胆固醇合成主要由星形胶质细胞参与完成［4］。与此同时，活化的星形胶质细胞会释放出特异性标志物，包括代谢产物，蛋白和外泌体等到血液中［5］，有望成为临床AD 疾病进展筛查的的潜在指标。

鉴于大脑中胆固醇代谢及星形胶质细胞与AD 发生发展密切相关，本研究主要探究5xFAD 模型小鼠海马脑区中胆固醇合成通路关键基因的表达及调控；并使用Stattic 药物抑制脑内胆固醇合成的上游调控基因，探究对海马脑区星形胶质细胞的影响，进一步为阿尔兹海默症的筛查和治疗靶点提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料（1）仪器与试剂荧光显微镜（Nikon），GFAP 抗体（Cell SignalingTechnology），t⁃STAT3 抗体（Cell Signaling Technology），p⁃STAT3 抗体（Cell Signaling Technology），防荧光淬灭剂（YEASEN），BODIPY 染料（Invitrogen），RT 试剂盒（Novoprotein），qPCR 试剂盒（Novoprotein）。

1.2 实验动物实验使用雌雄C57BL/6 品系小鼠，AD 模型小鼠5xFAD（JAX#034840），由广东省医学实验动物中心提供，中山大学北校饲养，在整个实验过程中对动物的处置均符合动物伦理要求。

1.3 方法Stattic（MCE，美国）每次上午腹腔注射，实验组5xFAD 小鼠给药剂量为：20 mg/kg/day，对照组5xFAD 小鼠给等体积生理盐水，连续给药20 天。

1.4 测序分析海马组织测序数据来源于已发表文献［6］。样本来自12 月龄WT 及5xFAD，雌性及雄性样本各5 个。文库序列与小鼠基因组对比后，使用GENCODE v21 注释。Reads 用STAR（2.5.1b⁃static）定位，使用RSEM（1.2.22）对基因表达定量分析。使用edgeR 对不同基因型、不同性别海马组织差异基因表达进行分析，筛选出p value<0.01 差异基因制作热图，并使用ggplot2 包绘制热图。

1.5 RNA 提取及RT⁃qPCR 检测用Trizol 提取RNA，使用逆转录试剂将其逆转为cDNA，再使用qPCR 仪进行PCR 扩增，计算RNA 相对表达水平。

引物名称Fli1⁃for Fli1⁃rev Msx1⁃for Msx1⁃rev Gtf2b⁃for Gtf2b⁃rev序列ATGGACGGGACTATTAAGGAGG GAAGCAGTCATATCTGCCTTGG TGCTGCTATGACTTCTTTGCC GCTTCCTGTGATCGGCCAT TCGACCAGCCGTTTGGATG TTCGGGACAGATCATATCGCC

1.6 组织免疫荧光检测（1）BODIPY 染色脑片以1xPBS 漂洗。10%山羊血清室温封闭1 小时。BODIPY 室温避光孵育15 分钟后封片。（2）GFAP染色脑片以1xPBS 漂洗，GFAP 抗体孵育过夜。二抗室温避光封闭2 小时后封片。

1.7 Westernblot 检测小鼠接受Stattic 腹腔给药后20 天，取海马组织蛋白定量后取20 μg 上样，经电泳，转膜，封闭后，用t⁃STAT3，p⁃ STAT3 和β⁃actin 抗体4℃孵育过夜，二抗室温摇床孵育2 小时，加上HRP 底物发光液后成像。

1.8 统计学分析所有数据均以（平均值±标准误差）表示。只有两个分组的实验数据采用T 检验进行统计分析，超过两组则采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 12 月龄5xFAD 小鼠海马区胆固醇基因表达和胆固醇水平为探究5xFAD 在已出现认知差异的5xFAD小鼠海马区胆固醇合成相关基因水平，我们使用12 月龄海马组织测序结果进行分析。热图显示5xFAD 小鼠海马组织中胆固醇合成通路相关基因显著上调（图1A⁃B）。BODIPY 染色结果显示，12 月龄5xFAD 小鼠海马脑区和胼胝体区的胆固醇及中性脂质含量显著高于WT 小鼠（图1C⁃D）。

图1 12 月龄5xFAD 小鼠海马区胆固醇基因表达和胆固醇水平

2.2 5xFAD 小鼠胆固醇合成基因转录因子表达升高我们筛选出胆固醇合成基因的转录因子Fli1，Msx1 和Gft2b。qPCR 结果显示转录因子基因的表达水平在5xFAD 小鼠海马区中显著升高（图2A⁃B）。进一步对上游转录因子筛选后，发现胆固醇合成通路的转录因子受信号转录激活因子3（STAT3）调控。检测磷酸化STAT3 和总STAT3 蛋白水平后，发现5xFAD 小鼠海马组织中p⁃STAT3蛋白水平显著升高（图2C⁃F），提示STAT3 激活并上调胆固醇合成通路转录因子，使得胆固醇合成基因表达升高，最终导致脑组织中的胆固醇含量增多。

图2 调控胆固醇合成基因的相关转录因子表达水平

2.3 抑制STAT3 磷酸化改善5xFAD 小鼠海马区星形胶质细胞的激活对12 月龄WT 和5xFAD 小鼠连续20 天Stattic 给药后，WB 结果显示Sattic 有效抑制5xFAD 小鼠海马脑区中STAT3 蛋白水平的磷酸化（图3A⁃B），同时发现STAT3 抑制剂能减少皮层和海马区星形胶质细胞的激活（图3C⁃E）。

图3 STAT3 抑制剂改善12 月龄5xFAD 小鼠海马脑区中星形胶质细胞的激活

3 讨论

随着中国老年化社会到来，阿尔兹海默症已成为当今公共健康的难题。本研究通过对5xFAD小鼠海马脑区组织测序分析，发现5xFAD 小鼠海马区胆固醇合成相关基因和相关转录因子表达显著升高。已有研究揭示，线粒体胆固醇积累可增加神经元对Aβ 介导的神经毒性敏感性，减低线粒体抗氧化细胞保护功能，加重神经损伤［7］。我们对海马脑区进行胆固醇检测，观察到5xFAD 小鼠海马脑区中胆固醇在内的中性脂质含量显著升高。成年人大脑内胆固醇主要由星形胶质细胞产生。中枢神经系统中星形胶质细胞控制神经元和突触的稳态［8］。星形胶质细胞不仅检测和响应突触传递信号，其活化形式亦可反应机体的健康和疾病状态。

综上所述，我们发现12 月龄5xFAD 小鼠海马区胆固醇合成通路相关基因，转录因子表达显著升高。抑制转录激活因子STAT3 的磷酸化能够显著改善5xFAD 小鼠海马脑区中星形胶质细胞的激活。这些结果提示降低大脑中胆固醇的合成，可能改善AD 疾病的发生发展，成为AD 新的治疗靶点。此外，活化的星形胶质细胞会释放出特异性标志物，包括代谢产物，蛋白和外泌体等，结合脑脊液和外周血液中胆固醇水平，以及其他AD 生物标记物如p⁃Tau，Aβ，NFL 等共同检测，有望为AD 的筛查和诊断提供重要临床价值。