外泌体来源microRNAs在心肌肥大中的研究进展

2022-11-21徐慧秋李振汉徐崇俊黄玉瑾刘继纯

牡丹江医学院学报 2022年4期

徐慧秋，吴霏，李振汉，陆薇，徐崇俊，黄玉瑾，沈哲，刘继纯，陈浩

(皖南医学院1.临床医学院；2.药学院；3.公共卫生学院；4.弋矶山医院心内科；5.病理解剖学教研室，安徽芜湖 241000)

外泌体能够携带核酸、蛋白质以及miRNA等在细胞间递送，从而实现细胞间信息交流。心肌肥大的产生和发展过程涉及复杂的生物机制，包括多种信号传导通路，且各种信号途径之间交错联系，关系极为错综复杂。外泌体参与肿瘤、心血管疾病等的病理过程，是多种疾病的生物标志物，也是这些疾病治疗的潜在靶点。本文主要聚焦于外泌体在心肌肥大产生发展过程中的作用最新研究进展。

1 外泌体基本特征与作用机制

外泌体具有脂质双分子层结构，是由多囊体(multivesicular body,MVBs)与细胞膜融合分泌而来，直径40～100 nm[1]。MVBs通过内吞作用使得胞内聚集着细胞质中的各种生物活性物质，然后MVBs与质膜的融合，这些物质释放到细胞外环境，形成外泌体。外泌体通过包裹着的信号分子、RNA和miRNA参与旁分泌和自分泌过程[2]。脂质双分子膜上的配体可以靶向受体细胞，成为药物靶向载体的基础[3]。由于其低毒性、良好的稳定性和生物相容性，是药物和基因治疗的理想载体[4]。研究表明，这些膜结合蛋白使外泌体能够特异性到达特定组织或微环境。有时配体过大，膜蛋白的整合可能会干扰蛋白在表面的正确折叠和表达。因此，研究人员试图利用基因工程富集跨膜蛋白，如Lamp2b[5]。近年来，在心肌缺血部位，通过噬菌体技术发现了肽序列CSTSMLKAC。它与外泌体膜上的跨膜蛋白Lamp2b形成重组蛋白，靶向心肌组织。急性缺血、再灌注和慢性缺血模型中使用来自干细胞或全血的外泌体的研究表明，外泌体可以对心脏损伤起到保护作用[6]。

2 miRNA

近年来，非编码RNA在心肌肥厚中的作用得到了广泛的研究。非编码RNA由细胞转录而来，调节多种生物进程。其中通过影响心肌乙酰化过程，心肌肥厚可以得到控制[7]。miRNAs是内源性小分子非编码RNA，由17～24个核苷酸参与组成，主要通过互补结合靶mRNA 的3’UTR从而在靶基因转录和转录后的调控中发挥作用。miRNA具有生物多样性，有多种调控信息的情况。外泌体通过内吞途径向受体细胞释放脂质、蛋白质、DNA、mRNA、miRNA、siRNA和lncRNA，从而触发受体细胞的微环境。这几年来，细胞微环境方面研究较之以往更为深入，外泌体有着可以实现细胞间信号传递的能力，在成为生物信息载体上具有颇有潜力，由此受到了关注。外泌体miRNAs在血液、唾液、尿液等体液中均能检测到，且含量和结构在患者与正常人体液中都有所不同，因此外泌体miRNA可成为特定疾病的生物标记物。不同细胞来源的外泌体作为治疗心室重构的一种新方法，可以打破缺血微环境对干细胞治疗效果的干扰和限制，具有很大的优势和应用前景[8]。

3 不同来源外泌体对心肌肥大的作用

3.1 糖尿病心肌细胞糖尿病性心肌病是糖尿病患者特有的心肌疾病易引发心功能异常，进而发展心源性休克，严重可致死。糖尿病心肌细胞可以释放有害的外泌体，其中的热休克蛋白20(heat-shock protein 20,Hsp20)含量低于正常值。研究表明，Hsp20的过表达可显著减轻链脲佐菌素引起的心功能障碍、肥厚、凋亡、纤维化和微血管稀疏。近期研究显示，2型糖尿病大鼠心肌细胞释放的外泌体能够通过Hsp20表达的负调控因子miR-320的转移抑制心肌内皮细胞的增殖、迁移和管的形成。而伴侣蛋白Hsp20可以通过将细胞保护蛋白自身转移到外泌体中，从而教育心肌细胞中的外泌体[9]。并且这些外泌体蛋白可以被运送到心脏内的邻近细胞，导致氧化应激降低，心肌纤维化和凋亡减少，以及心肌血管生成增加。从而使糖尿病引起的心肌病得到缓解。这些结果表明，外泌体可以通过Hsp20的过表达而重新编程，从而在心肌细胞中起到保护作用。因此，通过Hsp20介导的心肌细胞外泌体有训练治疗糖尿病心肌病的潜力。

3.2 肥大性心肌细胞肥大性心肌细胞(hypertrophic cardiomyocytes,HCs)可由血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)诱发，干扰巨噬细胞中的炎症信号通路，而炎症性免疫微环境情况在心脏肥大的发展中有极大的影响。HCs衍生的外泌体通过miR-155诱导细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun N-终端激酶(c-jun n-terminal kinase,JNK)和p38的磷酸化。在巨噬细胞中过度表达miR-155促进了白细胞介素-6和白细胞介素-8的生产，反映了miR-155在巨噬细胞介导的炎症启动中的重要性。大量研究证明，miR-155还是已知的炎症调节因子。从HC培养基中分离出来的外泌体可以触发炎症细胞因子的分泌[10]。我们进一步发现，通过下调AGO2，可以阻止由HC衍生的外泌体诱导的炎症细胞因子的释放。这些结果表明，心肌细胞来源的外泌体将非编码RNA信息包装到巨噬细胞中，并通过调节基因表达参与受体细胞中的炎症过程。此前有报道称miR-155参与了MAPK信号通路的调节并在炎症反应的调控过程中发挥了关键作用。即来自肥厚心肌细胞的外泌体能够激活miR-155介导的MAPK通路，最终诱导巨噬细胞炎症，这在诊断和治疗心肌肥厚的有效性方面提供改进方向[11]。

3.3 心肌球源性细胞心肌球源性细胞(cardiac bulbous cells,CDCs)已在人体试验用于心肌梗死、杜氏肌营养不良和其他适应症。这些细胞通过其抗凋亡、抗纤维化、抗重塑、血管生成和心脏增生性的特性来改善组织修复。它们还通过分泌外泌体参与调节炎症反应进而保护心脏。高血压会引起心血管疾病和肾功能不全。由CDCs分泌的外泌体及其中含量最高的小RNA成分，Y RNA片段EV-YF1可以在心肌梗死后起到治疗作用。Cambier等发现注入CDC-exo或EV-YF1可在血压几乎无变化的情况下缓解由于Ang II增加导致的心肌肥厚和肾损伤。含有EV-YF1的外泌体或将成为高血压相关心血管和肾脏疾病引起的心肌肥大的新的治疗思路[12]。

3.4 人诱导多能干细胞分化的心肌细胞多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)是现今干细胞研究方面的热点。它可以分化成任意的体内细胞，进而形成身体的各种组织、器官。移植人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-derived cardiac cell,hiPSC-CC)诱导旁分泌机制，能促进血管和小动脉的生长，细胞迁移、增殖和存活。而在细胞之间通信，改善心肌肥厚这些作用可以通过hiPSC-CC外泌体来实现。研究表明，经过hiPSC-CC外泌体治疗后，实验动物的左心室功能、梗死面积、壁应力、心肌肥厚、凋亡和血管生成的情况都有改善[13]。在hiPSC-CC外泌体中合成的15种最丰富的miRNAs可以改善hiPSC-CM Ca2+瞬态振幅、凋亡抗性和ATP含量，这表明，这些miRNA可能作为心肌保护信号机制的细胞间信使，促进心肌梗死的恢复。其中hsa-miR-199a-3p的合成模拟物改善了小鼠心肌梗死模型的心功能和壁厚。人类诱导的过表达环素D2的hiPSC-CC外泌体可使急性心肌梗死的大型动物模型中移植的心肌细胞循环激活，由于该模型与人类心肌细胞的增殖能力相似，故该方法可能成为心肌肥大治疗的有效策略[14]。

3.5 间充质干细胞间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能干细胞，它具有自我更新和多向分化能力。它分化的方向十分广泛，因此常在临床上使用。机械性应力会导致心肌肥大。当压力超载时，miR-29a可能是骨髓间充质干细胞来源的外泌体中包含的关键调节物质，有助于心脏保护。miR-29家族，一个在成纤维细胞中富集的miRNA家族，被预测为参与胶原蛋白和其他细胞外基质生产的mRNA的抑制剂。有报道称，在肥厚性心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)患者中，循环miR-29a上调，这是评估肥厚性心肌病的潜在生物标志物。体外实验表明，过表达miR29a-3p可明显降低内皮素诱导H9c2心肌细胞的肥厚反应[15]。MSCs来源的外泌体显著保护心肌免受心肌肥厚，并在压力超载时保持心脏功能。MSCs来源的外泌体可以防止血管紧张素II刺激的细胞肥大。另一方面，MSCs来源的外泌体促进体外肌成纤维细胞的过早衰老，表明其在心脏重构中的抗纤维化作用。MSCs来源的外泌体保护心肌细胞免受病理性肥大[16]。

3.6 成纤维细胞成纤维细胞来自于胚胎时期的间充质细胞。心脏成纤维细胞外泌体分泌的增加是Ang Ⅱ诱导病理性心肌肥厚的一种新的旁分泌机制。miRNA-27a是心脏成纤维细胞来源的外泌体中所含的主要miRNA，与心肌细胞中的肥厚基因表达一起参与氧化应激。研究中，心力衰竭大鼠左心室非梗死区miRNA-27a过客链(miRNA-27a passenger strand,miRNA-27a*)明显上调，并被包裹入外泌体并分泌到循环中。生物信息学分析表明，PDZ和PDLIM5是miRNA-27a*的主要靶点之一，在心脏结构和功能中起着重要作用，并可能参与心肌肥厚的发生过程中。有数据表明，伴随着肥厚基因的上调，PDLIM5与miRNA-27a的表达一致，均下降。与正常心脏相比，梗死心脏外泌体中miRNA-27a*的丰度更高，并进一步证明培养的心脏成纤维细胞受Ang Ⅱ刺激分泌富含miRNA27a*外泌体，进入细胞外间隙，这抑制了PDLIM5翻译。导致心肌细胞肥大基因表达。体内研究表明，在充血性心力衰竭大鼠中给予miRNA-27a*抑制剂可部分阻断内源性miR-27a*表达，阻止肥厚基因表达，改善心肌收缩力。这些发现表明，心脏成纤维细胞分泌的富含miRNA27a*的外泌体有潜力作为心脏肥厚的旁分泌信号中介物，成为新的治疗策略[17]。

3.7 脂肪干细胞脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是来自于脂肪组织的一种干细胞。具有干细胞的所有特征，对亚健康、早衰等疾病起到缓解作用。心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,I/R)可引起心肌细胞凋亡。Lai等发现，ADSC分泌的外泌体(exosomes from adipose-derived stem cells,ADSC-exo)可减轻I/R诱导的心肌肥厚[18]。ADSC-exo处理的I/R小鼠心肌细胞中凋亡相关蛋白p-p53和 PUMA 以及肥大相关蛋白ETS-1、ANP的表达均显著降低。据报道，PUMA 和ETS-1都是miR-221/222的靶基因。RT-qPCR检测结果显示，I/R处理显著降低了miR-221/222的表达，而ADSC-exo处理增加了miR-221/222的表达。实验表明，I/R处理显著促进了miR-221/222敲除小鼠心肌细胞肥大，而ADSC-exo对其影响有抑制作用。由此可知ADSC-exo通过miR-221/miR-222/PUMA/ETS-1途径预防I/R诱导的心肌肥大。这对于I/R诱导的心肌肥大的防治有指导意义。

3.8 脂肪细胞当脂肪细胞和心肌细胞共培养，Fang等发现介导脂肪细胞和心肌细胞以调节心脏重塑的途径具体是脂肪组织中的PPAR+活化导致外泌体表达和释放miR-200a进入循环系统[19]。随后，含有miR-200a的外泌体靶向心肌细胞，其中的miR-200a抑制TSC1的表达，刺激mTOR信号诱发心脏肥大。故miR-200a拮抗剂治疗可以缓解心肌肥大。

3.9 内皮细胞内皮细胞是人体上皮细胞的一种。近年来研究表明，内皮细胞中的miR-126促进血管重构，减少纤维化，是抑制心脑血管相关疾病的重要因素。实验结果表明，脑缺血后小鼠的血清和心脏中miR-126表达显著降低，miR-126靶基因增加，心肌肥大程度增加。敲除内皮细胞中miR-126的小鼠脑缺血后心肌肥大程度则显著增加。并且用未敲除miR-126小鼠分泌的外泌体处理的小鼠与敲除miR-126小鼠分泌的外泌体处理的小鼠相比，显示出明显的miR-126表达增加，且心肌肥大程度降低。故内皮细胞分泌的含有miR-126的外泌体对于心肌肥大的治疗具有新的治疗指导意义[20]。