维生素D受体基因多态性与原发性癫痫的相关性

朱文叶 陈新元 李敏

摘要：目的：研究维生素D受体多态性与原发性癫痫的相关性。方法：通过病例对照研究，纳入71例原发性癫痫患者作为病例组，同期97例健康者作为对照组，抽取所有研究对象外周静脉血提取DNA，采用PCR-LDR法检测维生素D受体单核苷酸位点Cdx-2、 FokI、BsmI及ApaI的多态性。结果：病例组和对照组Cdx-2、FokI、BsmI、ApaI的基因型、等位基因、显性模型及隐性模型均没有统计学意义（P>0.05）。结论：维生素D受体单核苷酸位点Cdx-2、FokI、BsmI及ApaI可能与原发性癫痫的发生不相关。

关键词：维生素D受体;基因多态性;原发性癫痫

ABSTRACT： OBJECTIVE To investigate the association between vitamin D receptor gene polymorphism and primary epilepsy. METHEDS A case-control study was conducted in 71 patients with primary epilepsy and 97 healthy controls. DNA was extracted from peripheral venous blood of all subjects. Polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2、FokI、BsmI and ApaIwere detected by PCR-LDR direct sequencing. RESULTS There was no significant difference in all genotype frequency 、allele frequency 、dominant model and recessive model between case group and control group （P >0.05）. CONCLUSION The polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2 （rs11568820）、 FokI （rs2228570）、BsmI （rs1544410） and ApaI （rs7975232） may not be associated with primary epilepsy.

KEY WORDS： vitmin D receptor; gene polymorphism; primary epilepsy

癫痫是最常见及最具潜在危险性的、多种病因参与的一种慢性中枢系统疾病。目前关于癫痫确切的发病机制仍不清楚，一般认为是由多种大脑病理性改变的共同终点，如机械性创伤、出生缺氧、产伤、感染、中风、肿瘤。流行病学调查研究表明，遗传因素作为内因在癫痫的发病机制中扮演重要的作用[1-2]。进来年发现越来越多的基因通过多种机制参与机体功能和发育过程，对癫痫的发生发展产生影响。不同个体应用抗癫痫药物治疗的反应性有很大的差异，这些差异性可能源于影响药物代谢动力学的基因、影响药物药效学的基因和导致癫痫发作的基因突变[3-7]。

维生素D（vitamin D， VD）属于脂溶性维生素，是一种维持人体生命所必须的营养物质，除调节钙磷代谢、促进骨骼发育、调节生物细胞分化和免疫功能外，VD在神经系统调节方面也发挥着独特作用。VD缺乏会引发神经系统疾病，包括多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病以及癫痫等[8-11]。维生素D受体（vitamin D receptor， VDR）是核受体超家族成员之一，主要位于神经元和胶质细胞的细胞核中[12-13]。VDR与VD结合后通过信号通路的传导，在中枢神经系统发挥着重要作用。研究表明纠正VD缺乏状态可以控制癫痫发作，此外，动物实验研究表明 [11]增加小鼠海马区VD3 水平可以提高诱发癫痫的阈值;相反，敲除VDR会增加癫痫的发生风险。基于以上研究，我们推测VDR基因的多态性可能参与了癫痫的发生。因此，本研究将进行VDR SNPs Cdx-2 （rs11568820， G>A）， FokI （rs2228570， T>C）， BsmI （rs1544410， G>A）， ApaI （rs7975232， C>A）的多態性分析，探讨VDR基因多态性是否与原发性癫痫发生相关。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2020年3月至7月来自昆明医科大学第一附属医院神经内科的原发性癫痫患者共71例，其中男性26例（36.6%），女性45例（63.3%），年龄中位数为29（23，44），诊断标准符合《2017年国际抗癫痫联盟制订的癫痫发作及癫痫分类诊断指南》[14]。同期收集昆明医科大学第一附属医院体检中心健康受试者97例作为对照组，其中男性35例（36.0%），女性62例（63.9%），年龄中位数为37（30，47）。经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取以及纯度和浓度测定 采集研究对象外周静脉血2 ml，按照TIANamp Blood DNA Kit， DP348的说明书提取全血DNA，使用核酸蛋白分析仪对提取出的DNA 样本进行纯度和浓度鉴定， OD260值和OD280值在1.6～1.8之间为合格。

1.2.2 PCR反应和SNP检测 引物由安徽通用生物系统有限公司采用Primer3.0设计。PCR扩增：15 µL 体系：DNA 1 µL，10*bµffer1.5 µL，25 mmol/L 的 MgCl21.5 µL，10 mmol/L 的 DNTP 0.3 µL，10 µmol/L 上下游引物 0.15 µL，5 µmol/µL 的Tap 酶 0.3 µL，加 H2O 补足至15 µL。PCR扩增条件：94℃预变性3 min;94℃变性30s，55℃退火30 s;72℃延伸90 s;共35个循环，然后72℃延伸3min。 连接反应：10 µL体系：取 3µL PCR产物，10* Taq DNA ligase buffer 0.15 µL，Taq DNA ligase（40U/ul）0.125 µL，探针（10p） 0.01 µL，加 H2O 补足至10 µL。连接条件：94°C 30s，56°C 3min;共30个循环。然后取取1µL延伸产物，加8ul上样，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。

1.2.3 统计学分析 运用IBM SPSS （version 25.0; Armonk， NY， USA）进行统计分析。分类变量采用卡方检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg 平衡定律检验。采用Logisitc回归模型校正年龄、性别等变量，所有统计分析采用双侧检验，P <0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 经χ2在检验，病例组与对照组的性别构成无统计学意义（P = 0.943），两组性别构成均衡。

2.2 遗传平衡检验 病例组和对照组VDR 4个SNPs 的基因型其观察值与期望值之间分布近似（P >0.05），表明两组样本来自遗传平衡群体，具有群体代表性。

2.3 VDR基因多态性与原发性癫痫的易感性分析

所有样本进行VDR基因测序，BsmI未检测到AA基因型，经χ2检验病例组和对照组VDR 四个SNPs基因型频率无统计学意义（P >0.05）（见表1）;进一步采用多因素二元Logistic回归，对受试者的年龄、性别进行校正，分析各位点等位基因模型、显性模型和隐性模型与成人原发性癫痫的关系。结果显示： Cdx-2 、FokI、BsmI及ApaI在病例组和对照组中其不同模型的分布均无统计学意义（见表2）。

3 讨论

VD在神经系统中有调控脑发育、神经营养和保护、神经递质合成和神经免疫调节等重要作用，是人体必需的神经类固醇，参与大脑复杂的功能活动[7]。VD缺乏与癫痫具有相关性。人体内VD水平降低会增加癫痫发生发展的风险;而癫痫人群中，内在或外在因素会导致体内VD水平下降[15]。本研究选取了其中4个SNPs进行研究。

FokI位于VDR基因的5’末端，其多态性与神经保护相关，发生突变会增加帕金森病、阿尔兹海默病、多发性硬化等神经系统疾病的风险[17-18]。Jiang[19]等发现 FokI AC基因型、ApaI AA基因型在颞叶癫痫组和对照组中的分布有统计学意义。Cdx-2位于VDR基因的5’启动子区域，其多态性与2型糖尿病及胰岛素分泌受损相关[20]。戴[21]等发现Cdx-2的基因型在癫痫组和对照组的分布具有统计学意义，而等位基因的分布没有统计学意义，AG/（AA+GG）有统计学意义，Cdx-2的多态性可能与癫痫的发生相关。BsmI位于VDR基因的3’端第8内含子，其多态性研究主要集中在骨质疏松、糖尿病及神经系统疾病。研究表明VDR基因3’端BsmI、ApaI 均与神经系统疾病相关[22-23] 。

在本研究中所选取的VDR 4个SNPs在原发性癫痫和对照组中无论是基因型，还是各种基因模型中其分布均没有统计学意义，其中BsmI （rs1544410）突变纯合子 AA基因型在所有研究对象中均未检出，这与戴[21]等的研究结果一致，同样Jiang[19]等的研究中AA基因型的频率也极低，很可能是样本量太小导致的。VDR基因多态性可受种族、地域等因素影响，本研究所有样本来自云南地区的人群，因样本量较少且遗传背景不同，病例组和对照组统计可能存在偏倚，后续将扩大样本量，控制混杂因素如日照、VD摄入、种族、地域等，对原发性癫痫发病机制做进一步研究，若可以进行不同地区多中心研究。

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[基金项目] 云南省教育厅科学研究基金教师类项目（编号：2018JS197）

[作者简介]朱文叶，主管药师，研究方向：临床药理学，邮箱：ZWYkyfyy@163.com

[通讯作者]李敏，男，医师，研究方向：哮喘与基因组学，郵箱：869116714@qq.com