环状RNA在骨关节炎调控的研究进展

聂江波　　金明超　　方添顺　　蒋豪威　　李建有

[摘要] 骨关节炎（osteoarthritis，OA）是常見的关节退行性病变，常表现为关节疼痛及活动受限。不可逆的软骨退变与软骨下骨骨质破坏是其最主要的病理改变。OA早期诊断困难，大多数晚期患者因此接受关节置换。环状RNA（circRNAs）是一类特殊的非编码RNAs，由碱基组成闭环结构，广泛存在真核生物中。作为调节细胞代谢的重要分子，circRNAs近年来被发现在骨关节炎中异常表达，参与软骨破坏及关节无菌性炎症等生物学行为。同时，circRNAs的环状结构使其能在血液中稳定存在，具有骨关节炎早期诊断、疗效评估及治疗的潜力。现就circRNAs及其在骨关节炎调控的研究进展展开论述。

[关键词] 骨关节炎;circRNAs;病理机制;早期诊断

[中图分类号] R684          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）16-0148-04

Recent advances of circRNAs in pathological regulation of osteoarthritis

NIE Jiangbo JIN Mingchao FANG Tianshun JIANG Haowei LI Jianyou

Department of Orthopaedics， Huzhou hospital of Zhejiang University， Huzhou 31300， China

[Abstract] Osteoarthritis （OA） is a common age-related， degenerative joint disease， with severe joint pain and functional limitation.Advancement of degenerative changes in the joint cartilage and irreversible breakage of subchondral bone are the main pathological changes of OA. Due to the difficulty in early diagnosis of OA， most of advanced patients have to receive joint arthroplasty.CircRNAs， that RNAs with closed loop structure formed by bases， are specific non-coding RNAs in eukaryotic cells.Involving in regulating cellular metabolism， circRNAs are recently demonstrated to express in OA abnormally. Studies show that circRNAs play important role in cartilage destruction and aseptic inflammation. Meanwhile， circRNAs， that can exist stably in blood because of their ring structure， have great potential in early diagnosis， evaluation of therapeutic efficacy and targeted therapy of OA. The advances of circRNAs in pathological regulation of OA would be reviewed in this paper.

[Key words] Osteoarthritis; circRNAs; Pathological mechanisms; Early dignosis

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以疼痛、关节活动受限为特征的退行性病变，全身多关节可见，最常累及膝、髋等承重关节。早期药物治疗可一定程度延缓OA的进展，但大多数晚期患者不得不接受关节置换，带来巨大的医疗负担。OA的病理改变累及整个关节，主要为软骨退变及软骨下骨硬化。多种机制参与其形成，包括软骨细胞凋亡、细胞外基质降解、炎症及遗传学因素等[1]。研究其病变机制对于早期干预、逆转OA进展至关重要。

环状RNAs（circular RNAs， circRNAs）是一种特殊的非编码RNA，是由碱基单链组成的稳定闭环结构，不具备5’帽和3’多聚腺苷酸尾[2]。其广泛存在于真核生物中，具有时间特异性和组织特异性。由于实验技术的限制，低表达量的circRNAs曾被视作前信使RNAs（pre-messenger RNAs，pre-mRNAs）错误剪切的产物。而随着生物信息技术的发展，circRNAs被证实能够调控基因的剪切、转录、直接编码蛋白及多肽的合成，参与多种疾病的发生和发展[3]。近年来研究发现，部分circRNAs与OA的发病机制相关。本文将对circRNAs在OA发病机制调控的研究进展进行综述。

1 circRNAs

早在1970年，Sanger等[4]通过电子显微镜在高等植物中发现了具有环状结构的RNA类病毒。随后，有研究者通过PCR扩增技术及测序技术验证了circRNAs的存在[5]。而直到2013年，人们首次提出circRNAs功能分析的方法，真正意义上打开circRNAs研究的大门[6]。随着研究不断深入，circRNAs的生成及作用机制更为清晰。

1.1 circRNAs的分类及生成

基因的各个片段，包括外显子、内含子、非翻译区等，都能够生成circRNAs。根据来源差异将circRNAs分为3种类型：外显子circRNAs（exonic circRNA， ecircRNAs）、内含子circRNAs（circular intronicRNA，ciRNAs）、外显子-内含子circRNAs（exon-introncircRNA，EIciRNAs）。其中外显子circRNAs主要存在于细胞质中，最为常见。circRNAs与mRNAs的前体均为pre-mRNAs。基因在RNA聚合酶Ⅱ的催化下转录生成pre-mRNAs，再通过剪切与修饰生成线性的mRNAs。与之不同的是，pre-mRNAs生成circRNAs需要环化机制参与[7]。目前主要研究的机制包括外显子跳跃环化、内含子配对驱动的环化、内含子套索驱动环化及RNA 结合蛋白驱动的环化[8]。

1.2 circRNAs的生物学功能

circRNAs主要通过4种途径发挥生物学功能：（1）miRNAs的分子“海绵”作用，circRNAs具有miRNA響应原件（miRNA response elements，MREs）能够结合特定的miRNAs，发挥竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）的功能，调控mRNAs的表达。ciRS-7是首个被发现有70多个选择性miRNAs结合位点的circRNAs，其能够竞争性结合miR-7调控Argonaute的表达[6]。（2）RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）的“海绵”作用，RBPs参与多种细胞生物功能，而circRNAs被证实能够结合RBPs，形成稳定的RNA-蛋白复合体（RNA-protein complexes，RPCs），发挥调控作用。如circ-Foxo3与CDK2及p21结合形成circ-Foxo3-p21-CDK2复合物，阻断细胞周期进程[9]。（3）编码蛋白质/多肽，既往认为，circRNAs不存在游离的5’帽结构，不能够翻译蛋白质。而最新的研究发现，部分circRNAs可以通过非帽依赖机制编码蛋白质/多肽。如通过滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）机制、甲基化修饰m6A驱动或直接结合多聚核糖体等方式翻译下游蛋白。（4）调节转录及RNA剪切，circRNAs能够影响RNA聚合酶Ⅱ的活性调节转录，或直接调控pre-mRNA的选择性剪切。如ci-ankrd52能够调控RNA聚合酶Ⅱ促进ankrd52的转录，敲除ci-ankrd52将下调亲本基因的表达[10]。

2 circRNAs与骨关节炎

软骨退变是OA最重要的致病机制。参与软骨退变的因素有很多，如软骨细胞凋亡、衰老、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的代谢障碍、炎症等[11]。circRNAs在其中发挥重要作用。研究发现，OA患者关节软骨及滑膜组织中存在circRNAs异常表达。Liu等[12]通过聚类分析发现，退变软骨相较于正常软骨存在71个差异circRNAs，其中55个circRNAs在退变软骨中下调。随后进一步对比OA患者同一关节的负重区和非负重区软骨，检测到104个circRNAs表达差异，其中应力相关的circRNA-MSR与OA进展相关[13]。此外，Xiang等[14]对10例关节滑膜组织（5例正常、5例OA）进行RNA测序，发现滑膜中存在122个差异circRNAs。在非负重关节OA患者的滑膜中，差异circRNAs大小约为300～3000 bp，主要来自于1号染色体，极少来自性染色体，并且大部分能够调控免疫活性[15]。同时，这些circRNAs可以调控TGF-β、HTLV-1、Wnt等信号通路及炎症因子的生成参与ECM合成和软骨细胞代谢[16， 17]。深入研究circRNAs在OA发生发展的作用机制，寻找到致病的关键因子，将为治疗早期软骨退变、逆转OA的进展提供新手段。

2.1 circRNAs与关节软骨细胞外基质的代谢

ECM是维持软骨细胞生存的微环境，由Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、水、弹性纤维等构成，其中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是最主要的功能物质。在正常软骨中，ECM的合成与分解相对稳定，各种因素导致的ECM分解增加都将影响关节软骨的正常结构与功能，诱发软骨退变。金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin like and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTSs）能够分解胶原蛋白和蛋白聚糖，参与ECM的降解，其中MMP-13主要降解Ⅱ型胶原。circRNAs结合miRNAs后可以调控MMPs的表达，如circTMBIM6竞争性结合miR-27a并沉默其功能，上调软骨中的MMP-13表达[18]。Liu等[12]发现circRNA-CER在OA负重区高表达，转染siRNA沉默circRNA-CER后，软骨中MMP-13显著减少，而miR-136表达上调，表明circRNA-CER通过抑制 miR-136发挥作用，促进MMP-13生成，加速ECM降解及软骨损伤。部分circRNAs能够同时调控MMPs与ADAMTSs参与OA进展。如hsa_circ_0005105、circGCN1L1分别结合miR-26a、miR-330-3p，抑制MMP-13及ADAMTS-4生成，转染hsa_circ_0005105、circGCN1L1后软骨细胞中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖减少[19，20]。

同时，hsa_circ_0005105、circGCN1L1可以诱发TNF-α及IL-1β等炎症因子的生成。炎症因子进一步刺激MMPs和ADAMTSs表达，形成正反馈效应加速ECM降解。并且炎症因子并不是单独发挥作用，而是通过瀑布式效应放大下游因子释放，形成交织的调控网络。研究发现，其他circRNAs也能参与调控炎症因子释放。如ciRS-7与circ-0136474存在拮抗作用，circ-0136474抑制miR-127-5p的功能，刺激TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放，损伤软骨活性，而ciRS-7结合miR-7后产生相反作用[21，22]。环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX2）催化前列腺素合成，诱导炎症反应。服用选择性的COX2抑制剂可以减轻OA患者关节内无菌性炎症，同时缓解患者关节疼痛。在IL-1β诱导的OA模型中，circRNA Atp9b结合miR-138-5p，参与诱导COX2表达，促进ECM的降解[23]。而circFADS2结合miR-489后，激活mTORs通路，抑制COX2、IL-6的产生，有利于保护关节软骨[24]。

CircRNAs结合miRNAs后，参与炎症相关通路，如NF-κB通路、髓样分化因子（MyD88）、MEK/ERK通路等，进一步影响ECM的代谢活动。NF-κB基因参与调控多种炎症反应，在OA患者软骨中显著增多，可以刺激MMPs表达。Ma等[25]发现circVCAN通过抑制NF-κB 通路活性保护关节软骨。MyD88属于Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）和IL-1受体家族，是调节NF-κB通路的重要适配器蛋白。CircRNF121是OA软骨细胞中MyD88的重要调节RNA，在IL-1β诱导的OA细胞模型中，miR-665与MyD88表达呈负相关，而miR-665是软骨细胞中circRNF121的直接靶点，circRNF121通过结合miR-665诱导MyD88表达，激活下游NF-κB通路，促进炎症因子及MMPs的释放[26]。研究证明，蛋白激酶信号通路广泛参与炎症调控过程。MAPK激酶1/2（MEK1/2）磷酸化激活ERK1/2，在OA發病过程中持续发挥作用。circRNA-CDR1as结合miR-641后，通过上调FGF-2表达激活MEK/ERK通路，诱发关节内炎症反应，破坏ECM[27]。

2.2 circRNAs与软骨细胞凋亡

软骨细胞凋亡是参与OA的重要机制之一，炎症反应与其密不可分。有越来越多的研究证据表明，circRNAs在通过炎症因子调控ECM降解的同时，参与了软骨细胞的增殖及凋亡调控。TGF-β作为公认的抑炎因子，同时广泛参与细胞生长分化的调节。Shen等[28]报道circCDK14依赖于miR-125a-5p/Smad2参与OA的调控，间接增强TGF-β抑制炎症及软骨细胞凋亡的作用。另有研究发现，部分circRNAs参与调控细胞生长相关通路。miR-193b可以直接靶向作用于胰岛素生长因子1受体（insulin-like growth factor 1，IGF1R），抑制细胞的增殖[29]。而hsa_circ_0045714结合并沉默miR-193b之后，OA软骨细胞凋亡数目显著减少[30]。Ma等[25]发现circVCAN表达与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达呈正相关。转染LV-circVCAN后，circVCAN及PCNA高表达，G0/G1期软骨细胞增多，S期显著减少，大量细胞进入增殖期，同时凋亡通路显著受抑制。

3 circRNAs与OA的早期诊断

诊断OA主要依赖临床症状和影像学检查，而明确诊断时关节软骨已显著破坏、不可逆转。目前仍缺乏OA早期诊断的有效方法。circRNAs广泛分布于各组织中，具有显著的组织特异性，并且其闭环结构能够耐受核酸外切酶，在组织及外周血中稳定存在[31]。同时，OA患者的关节软骨及滑膜组织中均存在circRNAs的异常表达。通过检测特定circRNAs能够有助于OA的早期诊断。Wang等[32]发现hsa_circRNA_0032131能够结合多个miRNA参与软骨退变，对于早期OA具备很好的诊断潜力。然而，关节穿刺获取组织标本可能进一步损伤软骨、加速OA的进展或导致关节感染。进一步研究表明hsa_circRNA_0032131在OA患者的外周血中也存在高表达。因此，检测血液中的circRNAs更具备OA早期诊断的应用前景。同样有研究报道hsa_circ_101178在OA患者的关节滑膜及外周血中高表达，并且在外周血中的表达水平与滑膜中表达水平存在相关性，能够用于评估患者OA的严重程度[33]。其他如hsa_circ_20014在OA及大骨结病血液中差异表达，可以作为诊断骨关节疾病的标志物[34]。

4 总结与挑战

近年来，随着测序技术及生物信息学的迅速发展，circRNAs越来越受关注。最新研究表明，circRNAs在OA患者的关节软骨及滑膜组织中差异表达，参与调控OA的发生发展。目前认为circRNAs主要通过miRNAs的分子“海绵”作用参与软骨退变、凋亡及炎症过程。而既往研究证实circRNAs可以直接翻译多肽和（或）蛋白参与疾病的发生发展。circRNAs-蛋白质通路是否参与OA病理生理过程仍不清楚。进一步寻找致病的关键circRNAs及研究circRNAs是否通过其他机制参与OA的病理过程十分必要。同时，众多的circRNAs与miRNAs组成调控网络发挥作用，其调节机制复杂，基于目前的研究尚不能完全阐述circRNAs作用的相关分子机制。如何合理利用生物信息学技术构建及发掘circRNAs数据库、通过数据分析预测相关的作用通路仍是研究的趋势。由于circRNAs能在关节液及外周血中稳定存在，其具备OA早期诊断及治疗的巨大潜力。部分外周血中circRNAs的表达量与OA分级存在良好的相关性，但其诊断的特异性和敏感度仍有待评估，需要大样本的临床研究。不过，随着技术进步以及对circRNAs研究的不断深入，circRNAs将可以切实地应用于临床。

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（收稿日期：2021-02-22）