miR-495靶向Notch1对神经胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响

胡耀文，李 鑫*，武利伟，解 靖，刘振杰，赵新岗

（1.河北省保定市第一中心医院神经外一科，河北 保定 071000；2.首都医科大学三博脑科医院神经外科，北京 100000)

神经胶质瘤是临床常见的原发性颅内恶性肿瘤，发病率高，治疗困难，因其转移快速、侵袭性强而预后极差、且易复发，对患者生命健康造成极大威胁[1-3]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一类内源性的非编码RNA，可与靶基因非翻译区靶向结合，从而调控其翻译表达。miR-495作为一种miRNA，可通过调控多种基因表达而介导肿瘤的发生发展，miR-495在人类胶质瘤、子宫内膜癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达下调，促进其表达，可明显抑制癌细胞增殖并促进其凋亡，发挥显著的抑癌作用[4-6]。Notch1基因可调控细胞增殖、凋亡、分化等多种生理进程，并可通过调控细胞周期和上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）过程而介导前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞癌等多种肿瘤的生长及侵袭转移，下调其表达，可延缓EMT进程，抑制癌细胞增殖，降低其侵袭转移力[7-9]。另外，在关于口腔鳞癌的研究中发现，miR-495可靶向下调Notch1基因表达，进而抑制口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭[9]。但miR-495靶向Notch1对神经胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响，目前还未有明确全面的阐述，本研究对此进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

人神经胶质瘤细胞U87（货号l110238）购买于上海北诺生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（货号T1300）、DMEM培养基（货号31600）、优级胎牛血清（货号S9020）、青链霉素混合液（货号P1400）、LipofectamineTM2000（货号11668）、高效RIPA裂解液（货号R0010）、CCK-8试剂盒（货号CA1210）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号PC0020）、逆转录试剂盒（货号T2240）、结晶紫染色液（货号G1062）购买于北京索莱宝科技有限公司；Opti-MEM培养基（货号31985062）购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒（货号556547）购买于美国BD公司；miR-495、U6、Notch1、GAPDH引物购买于上海生工生物工程股份有限公司；miR-495 mimics、miR-495 mimics阴性对照购买于上海吉玛基因有限公司；基质胶（货号wlb1062）购买于上海瓦兰生物科技有限公司；RNAiso Plus（货号9108）购买于日本Takara公司；SYBR Green Master Mix（货号A8605）购买于美国ABI公司；兔源Anti-β-actin一抗（货号ab227387）、兔源Anti-caspase-3一抗（货号ab32351）、兔源Anti-Bax一抗（货号ab32503）、兔源Anti-Vimentin一抗（货号ab193555）、兔源Anti-E-cadherin一抗（货号ab76319）、兔源Anti-Notch1一抗（货号ab52627）、羊抗兔二抗（货号ab150077）购买于美国Abcam公司。

1.2 主要仪器

多功能酶标仪、流式细胞仪、凝胶成像系统购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，型号分别是VARIOSKANLUX、Attune NxT、IBright CL 1500；光学显微镜购买于德国LEICA公司；核酸浓度测定仪购买于THERMO公司，型号Nanodrop little；高通量DNA合成仪、荧光定量PCR仪购买于美国Applied biosystems公司，型号分别是3900、7900 Fast；电泳仪、转膜仪购买于美国Bio-Rad公司，型号分别是EPS 300、Power-pac 3000。

1.3 实验方法

1.3.1 qRT-PCR实验检测神经胶质瘤组织和癌旁组织中miR-495表达 收集本院神经外科志愿者手术切除的神经胶质瘤组织和癌旁组织各6例，以RNAiso Plus分别提取其中总RNA，使用逆转录试剂盒均将其反转录为cDNA后，配制20 μL的qRTPCR反应体系：DEPC水6 μL+上游引物 0.8 μL+下游引物0.8 μL+ cDNA2 μL+ SYBR Green Master Mix10 μL+ ROX染料0.4 μL，均加入qRT-PCR反应管中，混匀后放入荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件参照说明书的指导设定，以U6作为miR-495的内参基因，通过2-ΔΔCt算法分析数据，获得组织中miR-495的相对表达量。qRT-PCR引物序列见表1。

1.3.2 体外培养并分组转染细胞 快速解冻后复苏购买的人神经胶质瘤细胞U87，离心5 min（1 000 r·min-1），弃去上清液，将细胞沉淀以5 mL完全培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清+100 U·mL-1青链霉素溶液）重新悬浮，混匀后接种在25 cm2培养瓶，平放入37 ℃细胞培养箱（5% CO2、95%湿度）中，进行无菌培养。

取上述处于对数生长期的U87细胞，接种在12孔细胞培养板中，放入37℃细胞培养箱无菌培养24 h，随机分为对照组、miR-495 mimics阴性对照组、miR-495 mimics组3组，参照说明书和文献[10]，分别使用50 μLOpti-MEM无血清培养基溶解miR-495 mimics阴性对照、miR-495 mimics，同时使用100 μLOpti-MEM无血清培养基溶解2 μL LipofectamineTM2000，配制LipofectamineTM2000溶液，然后各取50 μL与上述miR-495 mimics阴性对照及miR-495 mimics溶液混合，轻轻震荡均匀后，静置20 min，将培养板中完全培养基吸除，加入Opti-MEM无血清培养基，以配制的miR-495 mimics及miR-495 mimics阴性对照LipofectamineTM2000溶液处理细胞，6 h后吸除Opti-MEM无血清培养基，加入新的完全培养基继续培养，24 h后收集各组细胞，重复上述操作5次，收集5份细胞备用。

1.3.3 CCK-8实验检测细胞活力 取上述处于对数生长期的U87细胞，接种在96孔细胞培养板中，密度为每毫升1.0×105个，放入37℃细胞培养箱无菌培养24 h，参照1.3.2中的方法分组并转染细胞，每组设6个重复孔，并设6个孔不接种细胞，只加入完全培养基，做空白对照，转染后继续无菌培养细胞24 h，然后吸除完全培养基，加入新的完全培养基，并每孔加入CCK-8试剂继续培养2 h，放入多功能酶标仪中，测量450 nm波长下各孔吸光度，通过公式：细胞活力（%）=（实验组吸光度-空白对照组吸光度）/（对照组吸光度-空白对照组吸光度）×100%，计算各组细胞活力。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 1.3.2中收集的1份各组细胞各取含1×106个细胞的细胞悬液，离心5 min（1 000 r·min-1），弃除上清液，采用PBS溶液漂洗细胞沉淀后再次离心，弃除上清液，加入500 μL Binding Buff er+10 μL AnnexinV-FITC+5 μLPI的混合液，轻轻震荡均匀后，37 ℃避光孵育15 min，弃除上清液，加入500 μL PBS溶液，轻轻吹打混匀后，放入流式细胞仪中检测，通过Muticycle AV软件分析所得数据，计算各组细胞凋亡率。

1.3.5 Transwell小室侵袭实验及细胞划痕实验 1）分别检测细胞侵袭、迁移力Transwell小室侵袭实验[11]：Transwell上室中提前加入基质胶，4 ℃包被过夜，在Transwell下室中加入完全培养基，取1.3.2中收集的各组细胞1份，测定其密度后，分组接种在Transwell上室中，每个小室中含细胞1×105个，放入37 ℃细胞培养箱无菌培养24 h，弃去下室培养基及上室内细胞，以PBS漂洗下室细胞后加入4%多聚甲醛固定，然后以结晶紫染液孵育10 min染色后，显微镜下任选5个视野对细胞拍照并计数，重复3次，取平均值。2）细胞划痕实验[11]：取1.3.2中收集的各组细胞1份，测定其密度后，分组接种在6孔细胞培养板中，使用无菌直尺做标地物，以无菌枪头划一条直线，以PBS洗去划痕中细胞后，将细胞放回培养箱中继续培养24 h，显微镜下任选5个视野拍照并计数划痕中细胞，重复3次，取平均值。

1.3.6 qRT-PCR实验检测细胞miR-495和Notch1 mRNA表达水平 取1.3.2中收集的各组细胞1份，以RNAiso Plus分别提取其中总RNA后，参照1.3.1中的方法进行qRT-PCR实验，检测各组细胞中miR-495和Notch1 mRNA表达水平，以U6作为miR-495的内参基因，以GAPDH作为Notch1的内参基因。qRT-PCR引物序列见表1。

1.3.7 免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白、EMT相关蛋白及Notch1蛋白表达 取1.3.2中收集的各组细胞1份，以高效RIPA裂解液于冰水浴中裂解，2 h后4℃离心20 min（3 000 r·min-1），弃除上清液，以BCA法测定其中总蛋白浓度后，将各组蛋白调整至同一浓度，每组分别取20 μL加入上样孔中，110 V恒定电压下电泳后湿转，以5%脱脂牛奶室温孵育硝酸纤维膜2 h，封闭膜上蛋白，以兔源Antiβ-actin、Anti-caspase-3、Anti-Bax、Anti-Vimentin、Anti-E-cadherin、Anti-Notch1一抗孵育裁剪下的目的蛋白条带，4℃过夜后使用TBST溶液洗3次，加入羊抗兔二抗孵育，于摇床上室温轻摇2 h后，使用TBST溶液再次洗3次，条带上滴加增强型化学发光剂显色，放入凝胶成像系统中拍照，采用Image Lab软件分析条带上蛋白灰度值，计算出其相对表达量。

1.4 统计学方法

通过软件SPSS 24.0统计分析实验数据，计量数据以平均数±标准差（±s）表示，组间比较使用单因素方差分析，进一步两组之间比较行LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经胶质瘤组织和癌旁组织中miR-495表达水平比较

见表2。

表2 神经胶质瘤组织和癌旁组织中miR-495表达水平比较（±s，n= 6）

表2 神经胶质瘤组织和癌旁组织中miR-495表达水平比较（±s，n= 6）

注：与癌旁组织比较，# P＜0.05

组别 miR-495/U6癌旁组织 1.01±0.27神经胶质瘤组织 0.42±0.08#

2.2 各组U87细胞活力比较

见表3。

表3 各组U87细胞活力比较（±s，n = 6） %

表3 各组U87细胞活力比较（±s，n = 6） %

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别 细胞活力对照组 100.00±0.00 miR-495 mimics阴性对照组 98.79±20.05 miR-495 mimics组 47.02±8.73#

2.3 各组U87细胞凋亡情况比较

见图1、表4。

图1 流式细胞术检测各组U87细胞凋亡结果

表4 各组U87细胞凋亡率比较（±s，n = 6） %

表4 各组U87细胞凋亡率比较（±s，n = 6） %

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别 细胞凋亡率对照组 3.51±0.57 miR-495 mimics阴性对照组 3.49±0.60 miR-495 mimics组 56.72±8.54#

2.4 各组U87细胞迁移情况比较

见图2、表5。

图2 细胞划痕实验检测各组U87细胞迁移结果（×200）

表5 各组U87细胞迁移数比较（±s，n = 6） 个

表5 各组U87细胞迁移数比较（±s，n = 6） 个

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别 细胞迁移数对照组 203.15±42.56 miR-495 mimics阴性对照组 198.96±50.23 miR-495 mimics组 27.13±6.35#

2.5 各组U87细胞侵袭情况比较

见图3、表6。

图3 Transwell侵袭实验检测各组U87细胞侵袭结果（×400）

表6 各组U87细胞侵袭数比较（±s，n = 6） 个

表6 各组U87细胞侵袭数比较（±s，n = 6） 个

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别 细胞侵袭数/个对照组 178.64±35.72 miR-495 mimics阴性对照组 171.57±42.68 miR-495 mimics组 23.69±6.03#

2.6 各组U87细胞凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax)及EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达水平比较

见表7、图4。

图4 免疫印迹检测各组U87细胞凋亡及EMT相关蛋白表达结果

表7 各组U87细胞凋亡及EMT相关蛋白表达比较（±s，n= 6）

表7 各组U87细胞凋亡及EMT相关蛋白表达比较（±s，n= 6）

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别 Caspase-3/β-actin Bax/β-actin Vimentin/β-actin E-cadherin/β-actin对照组 0.37±0.06 0.41±0.08 1.31±0.26 0.68±0.13 miR-495 mimics阴性对照组 0.39±0.07 0.42±0.09 1.32±0.28 0.70±0.15 miR-495 mimics组 0.92±0.23# 0.90±0.21# 0.76±0.14# 1.34±0.29#

2.7 各组U87细胞miR-495和Notch1表达水平比较

见图5、表8。

表8 各组U87细胞miR-495和Notch1表达水平比较（±s，n= 6）

表8 各组U87细胞miR-495和Notch1表达水平比较（±s，n= 6）

注：与对照组比较，# P＜0.05

组别mRNA相对表达 蛋白相对表达miR-495/U6 Notch1/GAPDH Notch1/β-actin对照组 1.01±0.24 1.02±0.25 0.96±0.18 miR-495 mimics阴性对照组 1.00±0.26 0.99±0.27 0.95±0.17 miR-495 mimics组 2.34±0.52#0.41±0.08# 0.28±0.05#

图5 免疫印迹检测各组U87细胞Notch1蛋白表达结果

3 讨论

神经胶质瘤是一种中枢神经系统恶性肿瘤，以生长迅速、侵袭强劲、转移速度快为显著特点，如今临床常用治疗手段为手术后进行放、化疗，但总体疗效并不明显，患者平均生存时间只有约18个月，因此探索新的作用靶点对神经胶质瘤的临床治疗具有重要的价值[12-13]。miR-495是一种抑癌基因，介导人胶质瘤、子宫内膜癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的发生发展[4-6]，促进其表达，可明显抑制口腔鳞癌及胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭过程[14-15]。另外，miR-495在胶质瘤组织中表达显著下调，并与患者3年总存活率呈正相关，与胶质瘤的恶性程度呈负相关，因而miR-495可作为治疗胶质瘤新的潜在靶点[16]。本研究通过qRT-PCR实验检测神经胶质瘤组织和癌旁组织中miR-495表达水平，结果显示，相比癌旁组织，神经胶质瘤组织中miR-495表达水平显著降低，而以miR-495 mimics提高U87细胞中miR-495表达，可显著降低其细胞活力、迁移和侵袭数、Vimentin蛋白表达，并显著升高细胞凋亡率、Caspase-3、Bax和E-cadherin蛋白表达，表明miR-495可介导人神经胶质瘤的发生发展过程，上调其表达，可抑制胶质瘤细胞增殖，促进其凋亡，并抑制其转移侵袭性。

Notch1是miR-495的一个靶基因，miR-495可负靶向调控Notch1基因表达[9,17]，促进高糖诱导的视网膜神经节细胞凋亡，抑制miR-495表达，可保护视网膜神经节细胞免于高糖造成的损伤[17]。另外，Notch1可介导食管癌、宫颈癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长过程，下调其表达，可显著降低食管癌细胞活力，抑制其侵袭和迁移；以Notch1抑制剂DAPT处理宫颈癌细胞，可增强顺铂对其的杀伤力；抑制Notch1信号，可明显降低前列腺癌异种移植瘤的生长[18-19]。但miR-495是否通过靶向调控Notch1表达而影响神经胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，目前还没有明确阐述，对此进行了初步研究，结果显示，以miR-495 mimics处理U87细胞，可显著降低Notch1 mRNA和蛋白表达，表明miR-495能靶向下调Notch1表达，诱导神经胶质瘤细胞凋亡，降低其细胞活力，并减轻其迁移及侵袭。

综上所述，miR-495可减弱神经胶质瘤细胞增殖活性，促使其凋亡，并降低其侵袭转移能力，靶向下调Notch1表达可能是其作用机制，为神经胶质瘤的临床治疗提供了新的理论依据，并为其找到了一种新的治疗策略，但本研究未通过上调并下调Notch1基因表达来进行对照验证，存在一定不足，后续还应深入研究。