应用思维导图构建人血白蛋白含量测定方法的教学研究*

司鑫鑫，张 晓，付 免，李婷婷，马卫兴

(江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005)

蛋白质是生物体内一种重要的高分子有机物，是由氨基酸通过肽键连接而成的含氮高分子化合物。蛋白质的含量测定是生物化学分析的一项基础工作，也与食品、营养、医药、化工材料等领域的研究密切相关。目前蛋白质的含量测定方法较多，不同种类蛋白质组成及结构等不同，应选择适宜的并经方法学验证的含量测定方法，常见的如凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法等。

人血白蛋白(albumin)是人血浆含量最多的蛋白质，作为一种从健康人血液中提取的药物制剂，临床主要用于增加循环血容量和维持体内胶体渗透压。其作为一种静脉输注药物可直接注入人体，在临床应用广泛，主要用于治疗急症患者，例如严重失血创伤、严重烧伤引起的低血容量休克、脑水肿或肝硬化及肾脏疾病引起的水肿或腹水等[1-2]。由于该血液制品的来源特殊，对于制剂中白蛋白含量的检测及整体制剂质量的控制要求和相应的检测效率要求逐渐增加。其中，蛋白含量是人血白蛋白等血液制品的关键性生化指标[3]。《中国药典》2015版通则0731明确了人血白蛋白产品蛋白质含量的测定方法，目前，国内被《中国药典》收载的用于人血白蛋白蛋白质含量的检测方法主要有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等5种[4]。此外，本文搜集整理了近几年有关人血白蛋白含量测定的文献，并对这些方法进行了分析，按人血白蛋白的不同特性进行了归类整理，最终汇总得到了基于人血白蛋白的光学特性、配位特性、离子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等而建立的六大类分析方法。

蛋白质类药物分析是生物药物分析课程的重要组成部分之一，其内容逻辑性强、知识量大，学生普遍反映学习难度较大。教学工具的不断改进与实践，在提高教学效果方面发挥着重要作用。思维导图教学法作为一种新型教学模式，是一种符合人类大脑记忆空间的放射性特点的创新教学手段，可由一个中心主题连接相关联的各级主题，逐级向外扩展，图文并茂地展示主题，有助于制定更加科学合理的学习方案[5]。本研究将思维导图引入生物药物分析课程教学，以“蛋白质类药物-人血白蛋白的含量测定”教学内容为例，借助思维导图对教学内容进行立体设计，构建了层次分明的知识框架，构建了人血白蛋白基于光学特性、配位特性、离子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等特性而建立的分析方法(图1)，将琐碎、繁杂的知识点串联起来，帮助学生理解和记忆，激发学生学习兴趣，提高学生发散性思维能力，显著提高教学效果，值得推广。

图1 构建人血白蛋白含量测定方法的思维导图Fig.1 Mind map of human serum albumin content determination method

1 光学特性

1.1 吸光特性

人血白蛋白是人血浆中的一种蛋白质，氨基酸是组成蛋白质的最小单位，氨基酸通过脱水缩合形成肽链，是一条或多条多肽链组成一个蛋白质生物大分子。人血白蛋白由585个氨基酸组成的一条多肽链，其中蛋白质组成中含有芳香氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，这些芳香氨基酸中的芳环具有紫外吸光特性，利用这一吸光特性可建立紫外分光光度法用于人血白蛋白含量测定[6]。人血白蛋白最大吸收波长在280 nm处，其浓度在0.2～2 mg/mL范围内与其吸光度呈现良好的线性关系，可用于人血白蛋白制剂含量测定[7]。基于人血白蛋白的上述紫外吸收特性，结合高效液相色谱的分离功能，采用Hi-Pore RP-318型蛋白柱，流动相为pH 6.4的0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液，检测波长为280 nm，可用于人血白蛋白的定量分析[8]。

1.2 旋光特性

旋光度法测定蛋白含量主要是基于当平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的振动平面向左或向右旋转。人血白蛋白为左旋性物质，使用241MC-旋光仪，采用钠光谱D线，波长589 nm，测定管长1 dm，室温下测定，在浓度40～200 mg/mL与旋光度值呈良好的线性关系，可依据标准品浓度对旋光度的回归方程计算人血白蛋白的含量[9]。

1.3 折光特性

折光率法与旋光度法一样也是早期用于检测蛋白质含量的一种方法。折光率是物质的一种物理常数，不同的物质具有不同的折光率，人血白蛋白作为一种生物大分子，具有自己特定的折光率。使用WYY-1型医用折射仪，人血白蛋白浓度在5.0～20.0 g/dL时线性关系良好，可依据标准品浓度对旋光度的回归方程计算人血白蛋白的含量[10]。

2 配位特性

人血白蛋白的多肽链含有585个氨基酸，通过肽键(-CO-NH-)连接而形成具有类似双缩脲结构的特性，具有配位特性，在碱性溶液中与二价铜离子形成紫红色络合物，在一定浓度范围内颜色深浅与蛋白质含量成正比，以对照品溶液作标准曲线， 采用比色法即可测定供试品中人血白蛋白含量，可用于人血白蛋白注射液的含量测定[11]，中国药典2015年版三部也是采用本法进行检测。

3 离子特性

由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷，每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点，因此蛋白质在溶液中有两性电离现象[12]。当蛋白等电点(pI)与pH值相等时，该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0。在某一pH溶液中当pH>pI时该蛋白质带负电荷，反之pH

人血白蛋白也具有特定等电点，在较高pH下羧基解离成为人血白蛋白阴离子，在较低pH下氨基质子化形成质子化的人血白蛋白阳离子。在酸性条件下人血白蛋白阳离子可与马斯亮蓝G-250进行离子缔合形成蓝色缔合物，在595 nm处有吸收峰，人血白蛋白含量在5～25 μg范围内与其吸光度呈现良好的线性关系，可用于人血白蛋白制剂含量测定[14]。

4 分解特性

人血白蛋白与其它蛋白质一样，是含氮有机生物大分子，可与浓硫酸和催化剂一同加热消化分解产生硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成人血白蛋白含量，即含氮量*6.25=蛋白含量，这种方法就是凯氏定氮法。凯氏定氮法是经典的蛋白质定量方法，常将本法作为人血白蛋白含量测定的标准方法，用于新方法学开发的评价比较[15-16]。

5 密度属性

人血白蛋白具有密度属性，可用密度仪测定血液制品中的人血白蛋白含量[13-14]，即不同浓度的人血白蛋白溶液具有特定的密度，通过测定供试品密度的物理性质，建立一种密度与人血白蛋白含量的关联，可用于人血白蛋白制剂的含量测定[17]，使用密度仪测定时样品不需稀释， 适合于高浓度人血白蛋白含量检测。

6 免疫特性

人血白蛋白具有免疫特性，将人血白蛋白视作抗原，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高灵敏度的双抗体夹心试验技术，可用于测定人血白蛋白含量[18]。该方法的大致流程包括，将人血白蛋白抗体结合到固相载体，将待测抗原与之反应，再加入相应的酶标记抗体，最后加酶底物的显色液，颜色深浅和样品中蛋白含量呈线性关系(0～0.39 mg/mL)，从而实现定量检测[19-20]。

7 结 语

不同种类蛋白质组成及结构等不同，应选择适宜的并经方法学验证的测定方法。人血白蛋白具有多种特性，本研究借助思维导图这种可视化、简单易用的有效的教学工具，总结了基于光学特性、配位特性、离子特性、分解特性、密度属性和免疫特性而建立的不同的分析方法，可为设计人血白蛋白含量检测方法的教学分析提供新思路，适合于生物药物分析课程的特点，值得在今后的其他生物药物分析教学中进一步推广应用。