正交实验法优化栀子豉汤口服液中栀子苷和染料木素的提取工艺和制备工艺的研究*
2022-07-13孙思邈梁雨彤王秀海冯月男
孙思邈，梁雨彤，田 明，王 旭，王秀海，冯月男
（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）
引 言
栀子豉汤是中医经典名方，出自《伤寒论》，该方由栀子与淡豆豉组成，多用于更年期抑郁症，失眠，神经衰弱等疾病的治疗[1～2]。方中栀子为茜草科植物的果实，其主要化学成分为环烯醚萜（苷）类、有机酸酯类、萜类化合物、黄酮类化合物、挥发油成分以及一些多糖和各种微量元素[3]，其中环烯醚萜（苷）类中包含栀子苷和京尼平，而京尼平是导致栀子引起不良反应的成分之一[4]；淡豆豉为大豆成熟种子经发酵而成的加工品，其主要化学成分有丰富的蛋白质和脂类。淡豆豉中的大豆黄素和染料木素含量明显要高于大豆[5]，因此对于栀子豉汤中有效成分栀子苷和染料木素的提取对扩大栀子豉汤的临床应用具有重要意义。
栀子豉汤现代仍以汤剂形式用于临床，该形式的缺点是不便于储运、质量控制以及规模化生产。中药口服液是在汤剂基础上对其改进并得以发展的一种方便服用、药效迅速、吸收快且质量可控的新型制剂，市场上口服液形式的产品日渐增多，并在临床上广泛应用[6～7]。本课题将现代中药学与药剂学交叉融合，运用现代化科学理论及手段合理地设计了栀子豉汤口服液的制备工艺，以栀子中有效成分栀子苷和淡豆豉中有效成分染料木素为考察对象，以正交试验为方法筛选提取工艺，在保证有效成分最大程度保留的基础上确立最佳制备工艺，使其更好地适合于临床应用。
1 实验材料
1.1 药品与试剂
栀子，淡豆豉（由黑龙江中医药大学附属第一医院提供）。
栀子苷、染料木素（贵州迪大科技有限公司）；甲醇（色谱纯）、乙腈（DikmaPure）；甲醇（分析纯）、乙醇、磷酸（纯度100%，天津富宇精细化工有限公司）。
1.2 实验仪器
电子分析天平（ME55，METTLER TOLEDO）；电热恒温水浴锅（DZKW-A，北京京创泰宁伟业科技发展有限公司）；电热恒温减压干燥箱（DHG-9140，上海一恒科技有限公司）；医用数控超声波清洗器（KQ-500D 上海科导超声仪器有限公司）；高效液相色谱仪（Waters 2487UV 检测器，美国Waters）。
2 方法与结果
2.1 提取工艺的研究
2.1.1 吸水率和浸泡时间的考察
称取5 份药材，每份中栀子30g、淡豆豉20g，将药材破碎，置于烧杯中，各加水400mL，封口，放置，按照表1 中每个时间点各取1 份样品，滤除水分，称重，计算吸水率，结果如表1 所示。
表1 吸水率和浸泡时间的考察Table 1 The investigation of water absorption and soaking time
结果显示，60min 时吸水量呈饱和状态，吸水率为135%，但为减少误差和保证药材的充分浸泡[8]，最终选择浸泡时间为75min。
2.1.2 正交实验法考察提取工艺[9～10]
根据药材吸水量对加水量、提取时间、提取次数三个水平进行考察，采用L9（34）正交设计法优化提取工艺，因素水平见表2，试验设计结果见表3。
表2 栀子豉汤提取工艺的正交因素水平Table 2 The orthogonal factor level of Zhizichi decoction extraction technology
栀子30g，淡豆豉20g 按照表2 添加相应倍数的水，浸泡75min 后，回流提取，合并药液过滤，浓缩定容至200mL，备用。
2.1.3 栀子苷含量测定[11]
2.1.3.1 色谱条件
色谱柱SinoChrom（150mm×4.6mm，5μm）；流动相:甲醇（30）∶水（70）∶H3PO4（0.25）；波长:238nm；流速1.0mL/min；进样量10μL。
2.1.3.2 对照品溶液的制备
精密量取6.35mg 栀子苷对照品，甲醇溶解并定容至10mL，即为对照品储备液，待用。
2.1.3.3 供试品溶液的制备
精密吸取0.5mL 2.1.2 项下的提取液，先水浴蒸干，后甲醇再使结晶溶解并定容至25mL，经0.45μm微孔滤膜滤过，待用。
2.1.3.4 含量测定
精密量取10μL 栀子苷对照品溶液和10μL 栀子苷供试品溶液，利用高效液相色谱仪对栀子苷含量进行测定，实验结果见表3。
2.1.4 染料木素含量测定[12]
2.1.4.1 色谱条件
色谱柱SinoChrom（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈∶水∶冰乙酸（35∶63∶2）；检测波长：260nm；流速1.0mL/min；进样量10μL。
2.1.4.2 对照品溶液的制备
精密称定2.28mg 染料木素对照品，甲醇定容至10mL，经0.45μm 微孔滤膜滤过，即为供试品溶液，待用。
2.1.4.3 供试品溶液的制备
同2.1.3.3。
2.1.4.4 含量测定及结果
分别取10μL 2.1.4.2 项下的对照品溶液和10μL 2.1.4.3 项下供试品溶液，用于测定染料木素含量，结果见表3。
表3 正交试验结果Table 3 The orthogonal test results
2.2 结果处理分析
正交试验结果表明，B 因素和C 因素对有效成分的溶出有显著性影响，B 因素为主要因素，A 因素对提取效果的影响最小，差异无统计学意义，故以6倍量水最佳。根据实验数据与实际情况，确定A2B1C3为最佳提取组合，即6 倍量水浸泡75min 后加热回流提取1h，共提取三次，合并提取液，供下一步使用。
2.3 浓缩程度的考察
300g 栀子，200g 淡豆豉，取6 倍量水浸泡75min，提取3 次，每次1h，过滤，合并3 次滤液后浓缩至2500mL（相当于1mL 药液含0.2g 生药），取750mL 储备液（相当于150g 生药），分别浓缩至50mL、60mL、75mL、150mL，即1mL 含生药材分别为3.0g、2.5g、2g、1.0g。观察各浓度溶液的浓缩状态，于80℃时测相对密度，结果见表4。
表4 浓缩状态及相对密度Table 4 The concentration state and relative density
结果：当提取液浓缩至50mL（1mL 含生药材3g）时，浓缩液流动性差，挂壁严重，相对密度无法测定，因此选择60mL 为浓缩体积，每1mL 浓缩液含生药2.5g 为限度。
2.4 醇浓度的考察[13～14]
将2.1.2 项下储备液平均分成4 份，每份浓缩至1mL 含生药材2.5g,浓缩完成后再加入乙醇使浓度分别达到50%、60%、70%、80%，记录溶液状态，沉淀24h，过滤，回收滤液中的乙醇，浓缩后加水定容至60mL，静置24h 后记录每份样品的溶液状态，结果表明：乙醇浓度的变化对浓缩药液的醇沉效果的影响较大，药液中乙醇浓度为50%或60%时，醇沉效果不理想，表现为沉淀物与溶液中的沉淀物黏附松散；当药液中乙醇浓度调整到70%时，醇沉效果好，表现为沉淀粘结成团，且溶液澄清；而当乙醇浓度达到80%时，有漂浮物析出。综合以上结果，最终选择相对密度1.05～1.15（80℃）；醇沉浓度70%为最佳条件。
2.5 矫味剂蔗糖的用量
本品从口服液口感特点以及成品的成本角度出发，以蔗糖为矫味剂，将2.4 醇沉工艺制备的口服溶液按蔗糖量0%、5%、10%、15%、20%加入药液，搅拌使其溶化，静置后品尝口感。结果表明，蔗糖的用量不同对口服液的澄清度及pH 值无显著影响，当口服液中含15%蔗糖时味道较好，且符合中国药典的规定，因此蔗糖的用量定为15%（g/mL）。
2.6 制剂处方和工艺确定
栀子豉汤原方中15g 栀子加10g 淡豆豉为一日剂量，按照要求以1000mL 计算确定处方为栀子300g，淡豆豉200g，制成1000 个制剂单位（1000mL）。栀子豉汤口服液的规格为每支20mL，每次1 支，一日2 次。具体制备工艺如下：栀子300g，淡豆豉200g，6 倍量水浸泡75min，回流提取1h，共3 次，提取的药液浓缩至1.05～1.15（80℃）的相对密度，加乙醇使浓缩液中乙醇含量达到70%，搅匀，适宜环境放置24h，收集上清液，剩余药液过滤，将二者合并，回收乙醇，蒸馏水稀释，加150g 蔗糖后蒸馏水定容至1000mL，静置，过滤，灌装，灭菌，得成品。
3 结 论
本课题在优化栀子豉汤口服液中栀子苷和染料木素提取工艺时，为了保证药材有效成分的最大程度提取，对浸泡时间采取单因素试验进行考察，确定了浸泡时间为75min；以栀子苷和染料木素含量作为综合评价指标采取正交实验法进行考察，确定了最优提取工艺为6 倍水量回流提取1h、共3次；浓缩液的程度对口服液的存储及患者的使用口感有较大影响，因此，根据浓缩状态和相对密度对浓缩程度进行了考察，最终确定了提取液浓缩至60mL，限度1mL 含生药材2.5g，相对密度为1.05～1.15；根据口服液的用药特点，结合中药水提液中含有淀粉，多糖等易沉淀成分存在的影响，故对提取液进行了醇沉条件的筛选，选择浓缩液经乙醇醇沉，浓度为浓缩液的70%；对矫味剂蔗糖进行了用量考察，确定蔗糖含量为15%。实验确定了栀子豉汤的最优制备工艺，该工艺最大程度地提高有效成分栀子苷和染料木素的溶出率，且符合现代提取工艺的要求，建议后续进一步进行栀子豉汤口服液的稳定性研究与工业生产测试相关实验，为栀子豉汤口服液的量化生产以及高质量标准化制备流程的建立提供坚实的数据基础。
