三种产地柿子醋挥发性物质和有机酸成分分析

韩妍，仲美桥，史玉，黄一承，李晓磊，李丹

(长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室，长春 130022)

柿子(DiospyroskakiThunb.)又名长生果，主要分布在河北、山东和陕西等气候温暖、阳光充裕的地方。柿子富含糖类、蛋白质和粗纤维等物质，具有润肺养肺、健脾健胃的功效，味道香甜，口感清脆，深受国人的喜爱[1-2]。

食醋是人们日常生活中重要的调味品之一。中国传统食醋多以高粱、糯米、大米、麸皮等谷物为原料，通过液态发酵或固态发酵而制成。食醋可以增强食欲，促进消化。但食醋内蛋白质、纤维等含量较少，且风味单一[3]，所以果醋等越来越受到消费者的青睐。

柿子醋是在食醋的酿造基础上，以柿子原浆为原料，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵后接种醋酸菌(Acetobacteraceti)，最后完成醋酸发酵而成，其发酵过程中既保留了传统醋的风味，又增添了柿子特殊的果香。柿子醋具有增强食欲，调节人体pH值，补益气血，美容养颜等功效，逐渐成为研究的热点[4—6]。

柿子醋凭特殊的果香风味和较高的营养价值、保健功效深受消费者的青睐，但是关于柿子醋香味成分的分析研究匮乏。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱技术是风味研究常用的技术[7-8]。本研究应用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱技术对3种不同产地柿子醋的挥发性物质和有机酸组成及含量进行分析检测，通过层次聚类分析和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的方法对数据进行了分析处理，并研究了3种柿子醋的OAV值，为柿子醋的检测和品质评价提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市场购买的3种不同产地的柿子醋，分别为山西运城(醋A液态发酵)；河南洛阳(醋B液态发酵)；河南栾川(醋C固态发酵)；氯化钠(分析纯)：上海Aladdin公司；亚铁氰化钾(分析纯)：沈阳试剂三厂；硫酸锌(分析纯)：北京化工厂；乙酸、乳酸、苹果酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸和马来酸标准品：均为色谱纯，美国Sigma公司。

0.22 μm疏水式针式过滤器 上海安谱实验科技股份有限公司；顶空进样瓶(15 mL)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头 美国Supelco公司；DB-5MS UI毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国Agilent公司；Acclaim OA色谱柱(4.0 mm×250 mm×5 μm) 美国ThermoFisher Scientific公司；QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪 日本Shimadzu公司；Centrifuge 5430离心机 德国Eppendorf公司；Summit P680高效液相色谱仪 德国Dionex公司。

1.2 方法

1.2.1 HS-SPME-GC-MS分析

取0.50 mL柿子醋样品、1.50 mL蒸馏水和1.00 g氯化钠于15 mL顶空瓶中，加入10 μL 200 mg/L的2-辛醇溶液作为内标，并加入磁力搅拌子，密封置于200 r/min的磁力搅拌器上，每次萃取前50 ℃预平衡10 min。

HS-SPME条件：用已老化好的萃取头顶空吸附30 min，然后将萃取头拔出顶空瓶并迅速插入GC进样口解吸5 min，同时启动升温程序。

GC条件：进样口温度250 ℃，分流比为1∶10，5 min后吹扫流量20 mL/min；载气为He，柱流量1.0 mL/min；程序升温条件：初始柱温40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min的速率升至100 ℃/min，保持1 min；以5 ℃/min的速率升至190 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升至230 ℃，保持1 min。

MS条件：电子电离源，离子源温度230 ℃；GC-MS接口温度280 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围(m/z)35～600，全扫描模式。

定性方法：通过质谱与标准信息库NIST 16进行检索比对，并对C6-C30正构烷烃混合标样进行色谱扫描，计算香气成分的保留指数，并与相应文献值进行对照。保留指数按下式计算:

式中：Z为目标化合物流出前的正构烷烃所含碳原子数；N为目标香气物质左侧正构烷烃的碳原子数；tRa、tRN、tR(N+1)分别为待测香气物质、待测香气物质左侧和右侧正构烷烃的保留时间(min)。

定量方法：以2-辛醇作为内标物，通过SIM方法定量化合物含量。

1.2.2 OAV值计算

OAV法：查阅挥发性成分在水中的阈值，根据每种香气成分的质量浓度与阈值的比值计算其OAV，以此评价该香气成分对样品整体风味的贡献程度[9-11]。其中，OAV≥1的物质为特征香气成分。OAV按下式计算：

式中：Ci为香气成分的质量浓度(μg/mL)；OTi为香气成分在水中的阈值(mg/L)。

1.2.3 有机酸含量测定

分别准确称取一定量的草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、顺丁烯二酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、马来酸标准品，用流动相配制成10，20，5，20，10 mg/mL的标准溶液，再依次稀释成 0.830，1.670，0.520，1.670，0.280 mg/mL的混合标准溶液，用于进样分析。

取5 mL样品，用蒸馏水定容至50 mL，置于6000 r/min的离心机离心6 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

HPLC条件：流动相100 mmol/L Na2SO4(pH 2.65)；检测波长UV 210 nm；流速0.50 mL/min；进样量20 μL。

采用单点校正法进行定量分析。按下式计算：

式中：X为有机酸样品的质量浓度(mg/g)；A为测得有机酸样品的峰面积；A0为测得有机酸标准品的峰面积；C为有机酸标准品的质量浓度(mg/g)。

1.3 数据处理

通过Microsoft Office Excel 2016 对所得数据进行整理计算，通过TBtools进行层次聚类分析以及热图制作，采用SIMCA进行OPLS-DA分析。

2 结果与分析

2.1 3种不同产地柿子醋挥发性成分HS-SPME-GC-MS分析

表1 3种柿子醋样品中挥发性物质分析结果

续 表

将提取得到的柿子醋挥发性成分质谱图与NIST 11质谱数据库进行对比，将相似度超过 80%的组分保留。由表1可知，在3种不同产地的柿子醋中共鉴定出36种挥发性物质，其中酯类14种、醇类8种、醛类7种、酮类4种、酚类2种、酸类1种。这些化合物共同构成了柿子醋的独特风味，可以发现不同柿子醋中检测出的挥发性物质种类和数目具有差异，柿子醋挥发性物质不同可能是因为生产过程中的发酵工艺不同，不同产地的柿子香气成分也不同。

酯类物质是在柿子醋的发酵过程中，柿子中的有机酸和醇类物质发生了酯化反应，在微生物的代谢过程中氨基酸发生脱氨、脱羧而生成[12]。研究资料表明[13]，酯类化合物不仅对食醋的香气贡献了重要作用，还是食醋中有效物质最多的一项，这与本研究结果基本一致。在3种不同产地的柿子醋中，共鉴定出酯类化合物14种，乙酸苯乙酯是3种柿子醋的共有成分，其中醋A的含量最高，为736.46 μg/L，醋B和醋C中乙酸苯乙酯含量分别为9.42 μg/L和73.66 μg/L，乙酸苯乙酯具有微甜的香味和玫瑰花香，又带有苹果的果香和威士忌样的香韵[14]。乙酸苯乙酯还可用于治疗急慢性黄疸型肝炎和胆囊炎等疾病[15]。醋C中乙酸乙酯含量为386.07 μg/L，乙酸乙酯具有淡淡的果香和酒香，扩散速度快。

醇类化合物主要来自柿子醋的发酵阶段，包括有氧环境下柿子中的糖类转化、无氧条件下柿子中的氨基酸转化及相应的醛类化合物被微生物还原而生成。从3种不同产地的柿子醋中，共鉴定出8种醇类物质，其中醋C中醇类物质最多，含量为1005.11 μg/L，2-乙基己醇是3种柿子醋的共同风味物质，2-乙基己醇是香料中的香气物质。3种醋中含量较高的还有2,3-丁二醇和苯乙醇等。苯乙醇主要由苯丙氨酸经Strecker降解产生醛后进一步还原而生成，具有甜甜的玫瑰花香，其中醋C中苯乙醇的含量最高，达到了223.49 μg/L。

醛类化合物主要是在柿子醋的发酵过程中酯类氧化和降解反应产生的，Strecker降解反应也是其重要来源之一。在食醋的酿造过程中醛类化合物贡献了淡淡的焦香气味[16]。在3种不同产地的柿子醋中，鉴定出醛类物质共7种，其中含量最高的是3-糠醛，醋C中含量高达445.32 μg/L，醋B中含量为97.32 μg/L，其次是反式肉桂醛和3-甲氧基苯甲醛，醋C中含量分别为426.16 μg/L和177.06 μg/L。在3种柿子醋的醛类化合物比对中，醋C的醛类化合物含量最高，为1146.93 μg/L，其次是醋B中含量，为111.43 μg/L。

酮类化合物也是脂肪氧化和降解的产物之一，酮类化合物还是形成杂环类化合物的中间体。在3种柿子醋中，检测出2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、仲辛酮、1,3,3-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-酮共4种酮类化合物，根据文献[17]，2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮是食醋中常见的挥发性物质，2,3-丁二酮主要是发酵过程中的微生物，由乳酸和酵母代谢而产生，具有淡淡的奶香。此外，2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮可以相互转化。

2.2 3种柿子醋挥发性成分层次聚类分析及正交偏最小二乘判别分析

图1 3种柿子醋挥发性成分聚类热图Fig.1 Cluster heat map of volatile components in three kinds of persimmon vinegar

图2 3种柿子醋香气物质OPLS-DA的分数散点情况Fig.2 Scores plot of OPLS-DA model of aroma substances in three kinds of persimmon vinegar

为了对3种不同产地柿子醋中的挥发性物质进行研究，针对其含量进行了层次聚类分析，可以看到不同产地柿子醋中36种挥发性物质的分布规律。由图1可知，相对含量的高低由颜色的深浅决定，相对含量越高红色越深，相对含量越低蓝色越深[18-19]。

对图1进行纵向分析，可将柿子醋中的香气成分分为4个类别，分别为 I(苯甲醛～2,3-丁二醇)、II(2,4-二叔丁基苯酚～3-糠醛)、III(乙酸苯乙酯～2-甲基丁基乙酸酯)和 IV(苯甲酸～乙酸苄酯)。I类中主要是酯类和醇类物质，乙酸乙酯和苯乙醇为主要挥发性物质。在3种不同柿子醋中，醋C的乙酸乙酯和苯乙醇含量最高，乙酸乙酯微带果香和酒香，而苯乙醇具有清甜的玫瑰花香；II类中主要是醛类物质，主要是由柿子中的糖分在酸的作用下水解生成戊糖再经过脱水形成的，具有焦糖味；III类中主要物质是酯类物质，其中乙酸乙酯和乙酸苯乙酯含量较高，乙酸苯乙酯具有淡淡的玫瑰花香，这是柿子醋独特的味道之一；IV类中主要是苯甲酸，苯甲酸可以有效地抑制微生物细胞内呼吸酶系的活性，起到很好的防腐作用[20]。

通过OPLS-DA模型进一步分析3种柿子醋的差异。在OPLS-DA模型中R2X和R2Y代表模型对X和Y矩阵的解释能力，Q2表示模型的预测能力[21]。由图2可知，模型中R2X=0.986，R2Y=0.992，Q2=0.986，其中R2X=0.986表明该模型能反映98.6%数据的变化，R2和Q2均大于0.9，表明该模型具有较高的可解释度和预测能力。3种柿子醋样品在得分图上聚类良好，组内差异性小，3种样品之间完全分离，存在一定差异性。

2.3 OAV分析

柿子醋的整体风味取决于不同香气物质的浓度，同时与物质的察觉阈值密不可分，不同产地的柿子醋有其独特的风味。由于不同香气物质的特征及阈值不同，对风味特征的贡献也存在差异，通过OAV进一步分析挥发性香气的作用，所用阈值参考《化合物香味阈值汇编(第二版)》[22]及文献[23-24]。OAV≥1能被嗅觉感官所感知，OAV<1通常起到修饰味道的作用，但由于不同化合物间可能存在如协同、加成及掩盖等作用的相互影响。因此，对所有OAV>0.01的香气化合物均予以列出，见表2。3 种柿子醋中共有3种化合物的OAV>1，可能是主要呈香物质，按照挥发性风味特征，将3种柿子醋的香气分成2个系列，分别是苹果香和玫瑰香。

表2 3种柿子醋中香气物质OAV值Table 2 OAV values of aroma substances in three kinds of persimmon vinegar

续 表

2.4 HPLC分析有机酸含量

对3种不同产地柿子醋的有机酸含量进行分析，与标准有机酸混合溶液进行对照，醋A中有2种有机酸，醋B中有3种有机酸，醋C中有5种有机酸，见表3。

表3 3种柿子醋中有机酸含量

有机酸物质是食醋最重要的成分之一，赋予食醋特定的风味和感官属性。3种不同产地的柿子醋中均含有大量的醋酸。其中醋A中含量为37.7 mg/mL，醋B中含量为30.35 mg/mL，醋C中含量为13.35 mg/mL，而醋B中和醋C中柠檬酸的含量存在显著差异，其含量分别为 0.12 mg/mL和19.47 mg/mL，柠檬酸是一种重要的有机酸，有很强的酸味，易溶于水，是天然的防腐剂[25]。醋C中还含有酒石酸，酒石酸是一种天然的抗氧化剂，具有香甜的酸味[26]。其他酸类如乳酸和草酸等含量较少，但也对柿子醋的风味做出贡献。3种柿子醋中不挥发性酸的种类和含量不同，与生产过程中不同的原料和不同的发酵工艺有关，这些有机酸共同影响了柿子醋的酸味质量。

2.5 有机酸含量、阈值、TAV值及风味特征描述

3种不同产地柿子醋的5种有机酸含量见表4。

表4 3种柿子醋的有机酸浓度、阈值、TAV值及风味特征描述Table 4 Description of organic acid concentration, threshold values, TAV values and flavor characteristics of three kinds of persimmon vinegar

续 表

由表4可知，醋C中的柠檬酸和乳酸含量较高，分别为486.75 mg/mL和588.95 mg/mL。参考文献[27-28], 柠檬酸和乳酸共有特征风味略有涩感，这可能与柿子的表皮呈味略涩的缘故有关。根据研究表明，有机酸的含量和成分在调整时添加的酸和发酵的过程中酵母菌代谢产生酸有密切关系。

为探究风味中有机酸的影响，TAV可作为探究挥发性香气成分在食品基质中的贡献，TAV是更精准的标准。研究表明，TAV>1的物质对该样品呈现出的整体香气有贡献[29]。因此，根据TAV值对香味成分的分析进行了综合评价。3种柿子醋中的醋酸的TAV值特别高，这也是醋闻起来特别酸的缘故；除醋酸外，醋C中5种有机酸的TAV值均大于醋A和醋B，并且大于1，这也是醋C的整体风味丰富的缘故。

为进一步分析主要的风味特征，对其TAV值大于1的有机酸进行香气轮分析，见图3。其中醋A和醋B的主要风味特征是酸味呈刺激性，而醋C略带有微弱的香气，呈味略涩，略酸。

图3 3种柿子醋的有机酸香气轮图Fig.3 The aroma wheel diagram of organic acids in three kinds of persimmon vinegar

3 结论

通过HS-SPME结合GC-MS从3种不同产地的柿子醋中鉴定出36种挥发性物质，其中酯类、醇类和醛类含量最高，分别检测出14种、8种和7种。醋A酯类含量最高，为1205.87 μg/L；醋C醇类和醛类含量最高，分别为1005.11 μg/L和1146.93 μg/L。酯类物质中乙酸苯乙酯是3种柿子醋的共有成分，含量分别为736.46，9.42，73.66 μg/L；醇类化合物中2-乙基己醇是3种柿子醋的共同风味物质，含量分别为87.93，97.56，88.88 μg/L。

通过层次聚类分析及OPLS-DA进一步分析3种柿子醋的挥发性风味物质含量，发现3种柿子醋间香气物质含量存在差异。根据香气物质的OAV值，乙酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸苯乙酯是醋A中的关键风味化合物，乙酸异戊酯是醋B中的关键风味化合物。

柿子醋的有机酸测定结果表明，3种柿子醋中醋酸的含量最高且不同产地醋中醋酸含量存在明显的差异，3种柿子醋的醋酸含量分别为37.7，30.35，13.35 mg/mL。根据有机酸的TAV值，柠檬酸和乳酸对柿子醋的风味起到了重要的作用。