刺玫果总黄酮提取工艺优化及抑制脂肪酶活性研究

费子璇，周慧宁，张萌，李庆鹏，郭鑫蕊，张婧昳，张智勇，倪娜*

(1.内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028000； 2.中国农业科学研究院农产品加工研究所，北京 100193； 3.通辽市农业科学研究院，内蒙古 通辽 028015)

刺玫果又名硬皮刺梅(RosadavuricaPall.)，为蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木，常生长于我国北方的山地、林缘等区域[1]。刺玫果是一种“寓医于食”的植物，其花、果、根及根茎均可入药，花、果可以制作成果酱、馅料、饮品等[2-4]。刺玫果的花具有止血、理气、缓和情绪的功效，可用于治疗经血不调；刺玫果果实中含有高达4300～7200 mg/100 g的维生素C，被称为“维生素记录保持者”，可用于治疗维生素C缺乏症，还具有健脾胃、助消化的功效，可用于治疗胃腹胀满、小儿食积等。多项研究表明，刺玫果在降脂、保肝等方面作用显著，在预防肿瘤及抑制肿瘤细胞的增殖方面也有显著的功效[5-7]，刺玫果及其提取成分还具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗疲劳、抗血栓、增强免疫系统功能，以及增强骨髓细胞DNA、RNA和蛋白质合成等作用[8-10]。前人研究报道，许多植物的黄酮类物质具有抑制胰脂肪酶的活性[11-12]。现阶段对刺玫果的研究与开发利用主要集中在黄酮、多糖提取、生物活性等方面，但未见刺玫果提取物抑制脂肪酶效果的报道。

超声波处理是活性成分提取的有效辅助方法之一。超声波产生的空化作用使细胞中的微小气泡核在声压作用下不断振荡、生长直至崩溃解体[13]。空化作用能有效破碎细胞壁和细胞结构，加快目标成分的溶出速度，加速有效成分的提取[14-15]。超声波辅助提取具有提取时间短、溶剂用量少、萃取率高等特点，还能有效减缓高温对活性成分的破坏，与传统的提取方法相比更易于操作[16-17]。郑梅霞等[18]利用超声波辅助法提取了蒜苔中的总黄酮，其最大萃取率为0.6799%。孙协军等[19]的研究表明利用超声波辅助法可从山楂中提取出芦丁、槲皮素和金丝桃苷3种主要黄酮，优化后的总黄酮得率为0.0363%。王英等[20]利用超声波辅助法从苹果果皮中提取出总黄酮，当乙醇体积分数为60%、提取温度为60 ℃、提取时间为20 min、料液比为1∶25 (g/mL)时，萃取率为27.56 mg/g。

本研究采用超声波辅助溶剂提取刺玫果中的总黄酮，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应曲面设计对总黄酮提取工艺条件进行了优化，并对其抑制胰脂肪酶活性进行了研究，以期为刺玫果资源的开发和应用提供依据和参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

刺玫果干果：辽宁省新宾县；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；脂肪酶(LPS)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；奥利司他、K2HPO4、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等：均为分析纯试剂，国药集团化学试剂公司。

KQ3200V型超声波清洗器 金坛市荣华仪器制造有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV-5500PC型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Infinite M200PRO型酶标仪 瑞士TECAN公司。

1.2 试验方法

1.2.1 刺玫果总黄酮的提取

将刺玫果干果进行粉碎、过筛制成刺玫果粉末，密封保存。精确称量一定的刺玫果粉，按所需料液比，添加适量无水乙醇，置于超声波清洗器中提取一定时间，减压抽滤后旋蒸、定容，得到提取液。

1.2.2 标准曲线的绘制及黄酮萃取率计算

标准曲线的绘制参考郭磊等[21]的方法并略作修改。配制0.416 mg/mL芦丁标准液，精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL芦丁标准液，分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL，静置6 min；加入0.3 mL 10%的 Al(NO3)3溶液，静置6 min后加入4 mL NaOH溶液，用蒸馏水补齐至10 mL，充分振荡后静置3 min，测定吸光值(A508 nm)。以芦丁标准液浓度(mg/mL)为横坐标，以A508 nm为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为C=0.8848A-0.0052，R2=0.9926，表明线性关系合理，可以用于后续的试验参考。测量待测提取液的吸光度值，利用该回归方程计算出提取液中的总黄酮浓度，并利用公式(1)计算萃取率Y(%)。

(1)

式中：Y为黄酮萃取率，%；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为总黄酮提取液的体积，mL；N为稀释倍数；M为称取的刺玫果粉质量，mg。

1.2.3 单因素试验

以总黄酮萃取率为指标，采用单因素试验研究乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间对刺玫果总黄酮萃取率的影响，试验水平分别选取乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%、80%(料液比、超声时间和超声温度分别固定为1∶30 (g/mL)、45 min和45 ℃)；料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)(乙醇体积分数、超声时间和超声温度分别固定为60%、45 min和45 ℃)；超声温度20，30，40，50，60，70 ℃(乙醇体积分数、料液比和超声时间分别固定为60%、1∶30 (g/mL)和45 min)；超声时间30，40，50，60，70，80，90 min(乙醇体积分数、料液比和超声温度分别固定为60%、1∶30 (g/mL)和45 ℃)。

1.2.4 响应面设计

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken响应面设计优化刺玫果总黄酮的提取工艺条件。以黄酮萃取率为响应值，以乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间4个因素为自变量，拟合出4个因素之间两两交互的相应曲面，通过响应面法得出最佳提取工艺条件。各因素设置3个水平，因素水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.5 胰脂肪酶抑制率的测定

称取一定量的胰脂肪酶溶于0.067 mol/L PBS缓冲液(pH 7.38)中，配制成浓度为0.1 mg/mL的胰脂肪酶溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。利用脂肪酶(LPS)测定试剂盒测定胰脂肪酶活力。pH 7.4、37 ℃时每克胰脂肪酶每分钟水解1 μmol三油酸甘油酯定义为1个酶活力单位(U)[22]。以奥利司他为阳性对照，将刺玫果黄酮提取物冻干后溶于0.067 mol/L PBS缓冲液(pH 7.38)充分振荡混匀，配制成浓度分别为0.25，0.5，5，10，20，50 mg/mL的不同溶液，与等体积的0.1 mg/mL胰脂肪酶溶液混合后测定脂肪酶活力。参考公式(2)计算各种刺玫果总黄酮对胰脂肪酶的抑制率(%)，并求取半数抑制浓度(IC50)[23]。

(2)

式中：A为无抑制剂存在时胰脂肪酶的活性，U/L；B为抑制后胰脂肪酶的活性，U/L。

1.2.6 刺玫果黄酮类物质对胰脂肪酶抑制类型的确定

观察不同底物浓度下有无抑制剂存在时的反应速率，判断刺玫果总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用类型。胰脂肪酶溶液浓度为0.1 mg/mL，刺玫果总黄酮浓度为0，50 mg/mL，在底物浓度分别为0.27，0.216，0.163，0.108，0.054，0.027 mmol/L时，测定酶催化反应速率。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以底物浓度的倒数(即1/[S])为横坐标，以反应速率的倒数(即1/v)为纵坐标，绘制不同刺玫果总黄酮浓度的双倒数曲线图，拟合所得的直线在横、纵坐标上的截距分别代表酶催化反应的米氏常数Km和最大反应速率vmax的倒数。

1.3 数据分析

利用Excel 2010和Origin 2019软件进行数据拟合与绘图，运用Design Expert 11软件对响应面试验数据进行分析、优化、模型建立与检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对刺玫果总黄酮萃取率的影响

乙醇体积分数对刺玫果总黄酮萃取率的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对刺玫果总黄酮萃取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

由图1可知，随着乙醇浓度增加，刺玫果总黄酮萃取率先增加后减少，当乙醇体积分数为60%时总黄酮萃取率最高。依据相似相溶原理，乙醇体积分数小于60%时，随着乙醇浓度不断增大，其极性减弱，可以促进黄酮的溶出，刺玫果总黄酮萃取率上升；乙醇体积分数大于60%时，由于乙醇浓度过大会增加叶绿素以及其他杂质的溶出，它们与溶剂结合并影响黄酮类成分的溶出，导致总黄酮萃取率降低[24]。综合分析，选取60%为最佳乙醇浓度。

2.1.2 料液比对刺玫果总黄酮萃取率的影响

图2 料液比对刺玫果总黄酮萃取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

由图2可知，随着溶剂用量的增加，刺玫果总黄酮萃取率明显升高，当料液比为1∶20时总黄酮萃取率达到最大值，溶剂比例继续增加则总黄酮萃取率下降。当料液比尚未达到1∶20时，黄酮类物质溶解不充分，刺玫果粉与溶剂的接触面积随着料液比的不断上升而增大，溶出至溶剂中的黄酮类物质浓度不断增加，总黄酮萃取率升高[25]；当料液比过大时，溶剂中的总黄酮浓度较低，且过多的溶剂会增加后期浓缩的难度，导致产品损耗。因此，选取1∶20为最佳料液比。

2.1.3 超声温度对刺玫果总黄酮萃取率的影响

超声温度对刺玫果总黄酮萃取率的影响见图3。

图3 超声温度对刺玫果总黄酮萃取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

由图3可知，刺玫果总黄酮萃取率在超声温度为20～50 ℃时随着温度升高而呈现上升趋势，当超声温度在50～70 ℃时，总黄酮萃取率与温度变化呈负相关。当超声温度低于50 ℃时，温度的升高导致分子布朗运动的剧烈程度增大，溶剂分子与黄酮的碰撞次数增多，增加了黄酮类物质的溶出量；高温下总黄酮萃取率降低的原因是多方面的，温度过高使乙醇溶液蒸发，导致试样中提取溶剂减少，同时刺玫果中的黄酮类物质也会因高温而被氧化或分解[26-27]。因此，超声温度选取50 ℃为宜。

2.1.4 超声时间对刺玫果总黄酮萃取率的影响

图4 超声时间对刺玫果总黄酮萃取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

由图4可知，在30～80 min内，刺玫果总黄酮萃取率随着超声时间的增加而升高，当超声时间为80 min时总黄酮萃取率最大，而后继续延长超声提取时间，总黄酮萃取率反而减小。超声时间过长，热效应可能会导致氧化和分解等副反应的发生，破坏了黄酮类物质和黄酮的母体结构，同时物料中的不溶物、黏液质、多糖等杂质进入提取液，使提取液的浑浊度、黏度增加，增大了传质阻力[28-29]，使黄酮类物质的溶出速率大大减弱。综上，选取80 min为最佳超声时间。

2.2 响应面优化试验设计及结果分析

2.2.1 模型方程建立与方差分析

表2 设计方案及其试验结果Table 2 Design scheme and experimental results

续 表

响应面试验设计与结果见表2，使用Design Expert响应面分析软件对其完成二次回归分析，最终获得编码为A、B、C、D 4个因素与刺玫果总黄酮萃取率R的回归方程模型：R=1.24-0.0908A-0.0326B+0.0514C+0.0617D-0.1435AB+0.1173AC+0.0962AD-0.1065BC-0.0817BD-0.0210CD-0.1727A2-0.0583B2-0.1868C2-0.2457D2，对多元回归方程的方差分析见表3。

表3 回归模型方差和显著性分析结果Table 3 Variance and significance analysis results of regression model

由表3中方差分析结果可知，此回归模型的F=11.25，P<0.01，表示模型具有高度的显著性，失拟项P=0.1648>0.05，决定系数R2=0.9191，校正系数RAdj2=0.8382，说明模型拟合程度高，可以用于刺玫果黄酮提取最优工艺参数的预测。由F值可知，各因素对试验结果的影响依次为A>D>C>B，即乙醇体积分数>超声时间>超声温度>料液比。回归方程中，一次项乙醇体积分数(A)对模型的曲面影响为极显著(P<0.01)，超声温度(C)、超声时间(D)为显著(P<0.05)，料液比的影响不显著(P>0.05)。二次项中，A2、C2、D2均为极显著(P<0.01)，B2则为不显著(P>0.05)，而在对总黄酮萃取率的交互影响中，AB交互作用极显著(P<0.01)，AC、AD、BC交互作用显著(P<0.05)，BD、CD则为不显著(P>0.05)。

2.2.2 因素间的交互作用分析

乙醇体积分数和料液比、乙醇体积分数和超声温度、乙醇体积分数和超声时间、料液比和超声温度这4组因素间具有显著或极显著的交互作用，上述交互作用对刺玫果总黄酮萃取率影响的响应面图和等高线图见图5～图8。等高线图中，等高线为圆形表示因素之间交互作用较弱，为椭圆形则表示因素之间交互作用较强[30]。

图5 乙醇体积分数和料液比对刺玫果总 黄酮萃取率的影响Fig.5 Effects of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

图6 乙醇体积分数和超声温度对刺玫果 总黄酮萃取率的影响Fig.6 Effects of ethanol volume fraction and ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

图7 乙醇体积分数和超声时间对刺玫果 总黄酮萃取率的影响Fig.7 Effects of ethanol volume fraction and ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

图8 料液比和超声温度对刺玫果总黄酮萃取率的影响Fig.8 Effects of solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Rosa davurica Pall.

由图5～图8可知，在交互作用影响下，刺玫果总黄酮萃取率的变化趋势总体相似，即先增加后减少，4个响应因素在优化试验范围内都具有响应极值，4组因素间交互作用结果也与方差分析结果一致。由图5可知，乙醇体积分数与料液比的交互作用对刺玫果总黄酮萃取率影响的等高线图呈椭圆形，响应曲面横向跨度较大，表明两因素的交互作用对总黄酮萃取率存在极显著影响。图6和图7中交互作用对总黄酮萃取率的影响与图5相似，随着乙醇体积分数和超声温度(或超声时间)的增加，刺玫果总黄酮萃取率也呈现先增加后减少的趋势，乙醇体积分数对其影响更大，表现为响应曲面更为陡峭，等高曲线更为密集。由图8可知，当料液比一定时，不同超声温度下所对应的等高曲线更为密集，超声温度对总黄酮提取率的影响更大，这与回归模型的方差分析结果一致。

2.2.3 最佳工艺条件的确定及验证试验

通过软件对回归方程进行分析预测，超声辅助法萃取刺玫果总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数62.17%，料液比1∶15 (g/mL)，超声温度52.69 ℃，超声时间81.77 min，此时模型预测的萃取率为1.296%。结合实际操作情况，将其最佳工艺条件修正为：乙醇体积分数62%，料液比1∶15 (g/mL)，超声温度53 ℃，超声时间82 min，在此条件下对建立的模型开展验证试验，获得的刺玫果总黄酮实际萃取率为1.274%±0.031%，理论预测值为1.293%，相对误差不足2%，说明预测模型较为可靠，可应用于提取刺玫果中的总黄酮。

2.3 刺玫果总黄酮体外抑制胰脂肪酶能力

2.3.1 刺玫果总黄酮浓度对胰脂肪酶抑制率的影响

胰脂肪酶与膳食脂肪水解有密切关系，它能将人体摄入的50%～70%的食物脂肪水解为甘油和脂肪酸，而后在小肠中被吸收利用。若能抑制胰脂肪酶的活性，便能有效减少脂肪的水解和吸收，从而控制肥胖[31]。刺玫果总黄酮对胰脂肪酶抑制作用效果见图9。在刺玫果总黄酮浓度为0.1～50 mg/mL的试验浓度范围内，随着刺玫果总黄酮浓度的增加，其对胰脂肪酶的抑制率呈指数增加趋势。当刺玫果总黄酮浓度较低时，随着总黄酮浓度增加，脂肪酶的抑制率迅速增加，但当总黄酮浓度高于20 mg/mL时，抑制率缓慢增加，曲线较为平坦。

图9 刺玫果总黄酮浓度对胰脂肪酶抑制率的影响Fig.9 Effect of concentration of total flavonoids from Rosa davurica Pall. on inhibition rate of pancreatic lipase

由AAT Bioquest公司提供的计算程序求取出刺玫果总黄酮对抑制胰脂肪酶活性的半数抑制浓度IC50为0.659 mg/mL。胰脂肪酶抑制剂奥利司他阳性对照的IC50为0.045 mg/mL，这与文献中报道值0.072 mg/mL接近[32]，其差异可能来自于试验条件不同。对比可知，刺玫果总黄酮对胰脂肪酶的抑制能力低于奥利司他，但优于大多数已报道的植物提取物。由于刺玫果总黄酮尚未进行纯化处理，其中可能含有影响脂肪酶抑制效果的杂质，尤其是在浓度较高时，干扰作用更为明显。奥利司他是化学合成的减肥药物，虽已获批上市，但其抑制胰脂肪酶活性能力强，胃肠刺激大，严重干扰了正常脂肪代谢。刺玫果是我国允许使用的天然保健食品原料，其总黄酮经进一步纯化后，具备开发为新型减肥、降脂等功能性食品的潜力。

2.3.2 刺玫果总黄酮对胰脂肪酶的抑制作用类型

根据抑制剂与酶的结合方式不同，可逆抑制作用可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制等。依据Lineweaver-Burk双倒数方程作图，得出加入刺玫果总黄酮抑制剂和未加入抑制剂时的双倒数曲线，见图10。

图10 刺玫果总黄酮对胰脂肪酶抑制作用的 Lineweaver-Burk双倒数曲线图Fig.10 Lineweaver-Burk plots of inhibitory effect of total flavonoids from Rosa davurica Pall. on pancreatic lipase

由图10可知，两条直线相交于横坐标，即当体系中引入刺玫果总黄酮抑制剂时，酶催化反应的动力学参数米氏常数Km值保持不变，而最大反应速率vmax值逐渐降低，这符合典型的非竞争性抑制特点。表明刺玫果总黄酮可与底物同时与酶相结合，且二者间并无相互竞争作用，刺玫果总黄酮作用在酶活性中心以外的其他部位，影响了中间产物的进一步分解，从而使酶的催化活性降低。此结果与荷叶黄酮[33]、辣木叶黄酮[34]、黑豆提取物[35]对胰脂肪酶的抑制作用类型相似。

3 结论

本文通过对刺玫果总黄酮超声辅助提取工艺、刺玫果总黄酮对胰脂肪酶抑制作用及类型的研究得知：在乙醇体积分数为62%，料液比为1∶15 (g/mL)，超声温度为53 ℃，超声时间为82 min的条件下，刺玫果总黄酮的实际萃取率最高，可达1.274%±0.031%。刺玫果总黄酮对胰脂肪酶具有良好的抑制效果，其IC50值为0.659 mg/mL，其抑制类型为非竞争性抑制。刺玫果总黄酮是一种优良的胰脂肪酶抑制剂，具有开发为减肥、降血脂等功能性食品的潜力。