响应面法优化黄花菜黄酮提取工艺及抗氧化活性的研究

米智，刘荔贞，李慧

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学 化学与化工学院，山西 大同 037009)

黄花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)，又称金针菜、一日百合、忘忧草等，百合科萱草属多年生宿根草本植物，是我国传统的药食两用蔬菜之一[1]。又被称为“四大素山珍”之一，色泽金黄，香味浓郁，味道甘美，营养丰富，含有大量的碳水化合物、维生素、氨基酸、多酚类、类胡萝卜素、无机矿物质、香精油、黄酮类等多种成分[2-3]。《本草纲目》记载黄花菜有利胸膈、安五脏、清身明目、治小便赤涩、解烦热、除酒瘟、令人好欢无忧等药效。现代医学认为黄花菜具有抗氧化、抗菌消炎、抗抑郁[4]、镇静催眠、平肝养血、消肿利尿、镇痛、保肝、通乳等保健功能[5-7]。

据《中药大辞典》记载，黄花菜含有苷1.8%、黄酮类0.75%、生物碱0.7%、β-胡萝卜素0.36%[8]。黄花菜中黄酮类化合物是其重要有效成分之一，具有增强免疫力、活血化瘀、保肝抗炎[9]、抗菌抗病毒[10]、抑制肿瘤[11]、延缓衰老[12]、抗氧化[13]、清除自由基等多种保健功能[14-17]，由于其毒副作用较小、功能多等特点，其相关研究和开发，尤其是黄花菜及其总黄酮在制备抗抑郁药物领域，日益受到重视。

目前，黄花菜中总黄酮的提取工艺仍以传统的乙醇法、超声波法、微波萃取法等方法为主，本文采取的索氏提取法具有选择性好、能耗低、设备操作简便等优点，适用于实验室；黄酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇无毒且沸点低，适于索氏提取法进行黄花菜中黄酮的提取，且使用乙醇为提取剂具有回收利用方便，提取率较高，有利于降低生产成本等优点[18]。

本文以当年干黄花菜为研究对象，通过单因素实验与响应面分析的方法，优化索氏提取法提取黄花菜黄酮的最佳工艺条件，并采用清除DPPH、ABTS自由基的方法测定其抗氧化活性，以期为黄花菜中黄酮的提取及黄花菜的高值化综合开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干黄花：购于山西省大同市云州区万亩有机黄花种植基地；芦丁标准品、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、维生素C(VC)：均为分析纯，购于上海源叶生物科技有限公司；过硫酸钾(K2S2O8)；C2H5OH；Al(NO3)3；NaNO2；NaOH等。

1.2 仪器与设备

索氏提取器、精密电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、数显控温电热套、万能粉碎机、紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机等。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

精确称取芦丁标准品10 mg，加少许无水乙醇，在超声波辅助下，摇匀使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL芦丁标准液，参照米智等的方法制作芦丁标准曲线。

1.3.2 黄花菜处理及黄酮提取工艺流程

选择色泽鲜艳、长度均匀适中、无发霉、无损伤、无病虫害的干黄花菜，放入电热恒温鼓风干燥箱中，在45～50 ℃下干燥2 h后，用万能粉碎机粉碎成黄花粉末，并过60目筛，收集黄花菜粉末于干燥的容器中待用。

黄酮提取工艺流程：黄花菜→清选→烘干→粉碎→过筛→称重→分装→浸提→定容→测定→计算。

1.3.3 黄花菜黄酮的测定方法

精确量取1 mL浸提液作为待测液，方法同1.3.1，做3组平行实验求平均值，代入线性回归方程，得到黄花菜黄酮的含量。黄花菜黄酮提取量的计算公式为：

式中：C为黄花菜黄酮浓度，mg/mL；N为稀释的倍数；V为提取液总体积，mL；W为实验样品的质量，g。

1.3.4 黄花菜黄酮提取工艺的单因素实验

准确称取2 g黄花菜粉末，在乙醇体积分数为90%、料液比为1∶20(g/mL)的条件下，设置提取时间分别为1，1.5，2，2.5，3 h，提取黄花菜中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量；在料液比为1∶20(g/mL)、提取时间为2 h的条件下，设置乙醇浓度分别为80%、85%、90%、95%、100%，提取黄花菜中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量；在乙醇浓度为90%、提取时间为2 h的条件下，设置料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，提取黄花菜中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量。

1.3.5 响应面实验设计及统计学分析

根据黄花菜黄酮提取工艺的单因素实验结果，从提取时间(A)、乙醇浓度(B)和料液比(C)3个因素中，分别选取3个对黄花菜黄酮提取量影响较大的水平，以黄酮提取量为考察目标，运用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面实验设计，根据Box-Behnken中心组合设计原理，确定响应面实验方案，并建立回归方程预测模型确定最佳提取工艺参数。

1.3.6 黄花菜黄酮提取工艺的验证性实验

为了更好地验证索氏提取法提取黄花菜黄酮的可靠性和合理性，在响应面实验结果的基础上，进行了3次平行验证性实验，并计算相对标准偏差(RSD)。

1.3.7 黄花菜黄酮抗氧化性测定

1.3.7.1 黄花菜黄酮对DPPH自由基清除能力测定

根据响应面实验，在最优条件下提取黄花菜黄酮浓缩液，用无水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的样品溶液，分别精确量取以上溶液0.6 mL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液2.4 mL，混匀，在黑暗室温下反应40 min后，在517 nm处测定吸光值[19]。用Vc作为本实验的参照物，以半数清除率IC50值作为抗氧化活性评价指标，按照以下公式计算清除率：

式中：A对照为0.6 mL无水乙醇+2.4 mL DPPH溶液；A样品为0.6 mL黄花菜黄酮待测液+2.4 mL DPPH溶液；A空白为0.6 mL黄花菜黄酮待测液+2.4 mL无水乙醇。

1.3.7.2 黄花菜黄酮对ABTS自由基清除能力测定

精确量取7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等体积混匀，室温且避光条件下反应12～16 h，形成ABTS自由基离子(ABTS+·)储备液。测试前，将ABTS+·储备液用无水乙醇稀释至在734 nm波长下的吸光值为0.700±0.020，作为ABTS+·工作液于30 ℃保存待用。取黄花菜黄酮浓缩液，用无水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的样品溶液，分别精确量取以上溶液1 mL，加入ABTS+·工作液6 mL，混匀，在黑暗30 ℃下反应30 min后，在734 nm处测定吸光值[20]。以VC作为本实验的参照物，以半数清除率IC50值作为抗氧化活性评价指标，按照以下公式计算清除率：

式中：A对照为1 mL去离子水+6 mL ABTS工作液；A样品为1 mL黄花菜黄酮待测液+6 mL ABTS工作液；A空白为1 mL黄花菜黄酮待测液+6 mL去离子水。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以不同浓度芦丁(C，mg/mL)为横坐标，OD510吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程为：y=9.216x-0.102，R2=0.991。

2.2 黄花菜黄酮提取工艺的单因素实验结果

2.2.1 提取时间对黄花菜黄酮提取量的影响

图1 提取时间对黄花菜黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由图1可知，随着提取时间的延长，黄花菜黄酮提取量逐渐升高，并在2.5 h时黄酮含量达到了最高值，约为0.53%，当提取时间再延长，黄酮提取量略有下降。在做响应面实验时，选取提取时间为2，2.5，3 h作为3个水平。

2.2.2 乙醇浓度对黄花菜黄酮提取量的影响

图2 乙醇浓度对黄花菜黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由图2可知，黄花菜黄酮提取量随着乙醇浓度的提高而增加，并在90%和95%时达到最大值，均约为0.55%，当用无水乙醇提取时，黄花菜黄酮量反而有所降低。基于节约成本考虑，做响应面实验时，选取乙醇浓度为85%、90%和95% 3个水平。

2.2.3 料液比对黄花菜黄酮提取量的影响

图3 料液比对黄花菜黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由图3可知，黄花菜黄酮提取量随着料液比的增大而增加，并在1∶20时达到了最大值，约为0.55%，当料液比再增大时，黄花菜黄酮提取量反而降低。料液比为1∶15和1∶25时黄花菜黄酮的提取量相当，故在做响应面实验时，选取料液比为1∶15、1∶20和1∶25 3个水平。

2.3 回归模型的建立及其分析

响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

响应面实验方案与结果见表2。

表2 响应面实验方案与结果Table 2 Scheme and results of response surface experiment

建立黄花菜黄酮提取工艺参数的回归模型，获得本实验评价指标(黄花菜黄酮提取量)的响应值(Y，%)对自变量A(提取时间)、B(乙醇浓度)和C(料液比)的二次多项式回归方程：黄花菜黄酮提取量(Y，%)=-9.41375+1.0725A+0.17425B+0.056C+2.0E-3AB-0.011AC+3.0E-4BC-0.2A2-1.0E-3B2-1.5E-3C2。

以黄花菜黄酮提取量为评价指标，对该模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回归模型在统计学上呈极显著(P=0.0001<0.01)，说明实验模型有统计学意义；且由P值可知,模型中变量A、B、C、AC、A2、B2和C2对黄酮提取量的影响极显著，说明实验因素与响应值不是简单的线性关系，一次项、二次项及A和C的交互作用对响应值均有很大的影响；失拟项的P=0.2451>0.05，不显著，说明实验模型拟合度较好，模型选择合理，模型的残差可能来源于实验过程的随机误差。模型的校正决定系数RAdj2=0.9369，说明该实验中有93.69%的变异分布在方程的因子中，其总变异有6.31%不能由该模型来解释，R2值为0.9724，说明黄花菜黄酮的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，该模型可用于预测索氏提取黄花菜黄酮的实际情况。噪音信号比(Adeq Precision)为13.065>4，说明本模型能真实地反映实验结果；实验的精确度(C.V.)为2.39%，说明实验操作可靠[21]。在所选取的各因素水平范围内，对响应值的影响顺序为：乙醇浓度(B)>料液比(C)>提取时间(A)，且这3个因素均对黄花菜黄酮提取量影响极显著(P<0.01)。

通过三维响应面图和二维等高线图分析显示，随着提取时间、乙醇浓度和料液比的增大或延长，黄花菜黄酮的提取量也随之增大，但当提取时间、乙醇浓度和料液比增大或延长到一定程度后，黄酮提取量有下降的趋势，提取时间和料液比的交互作用对模型的影响极显著，其余均不显著，由图4中b可知，其椭圆程度和疏密程度与表3回归模型中的方差分析一致。

图4 提取时间和料液比对黄花菜黄酮提取量的 响应面图(a)和等高线图(b)Fig.4 Response surface diagram (a) and contour diagram (b) of extraction time and solid-liquid ratio on flavonoid extraction amount from Hemerocallis citrina Baroni

2.4 最佳提取条件的确定

由响应面软件分析可得出索氏提取黄花菜黄酮的最佳工艺为：提取时间2.64 h、乙醇浓度92.5%、料液比1∶18.23(g/mL)，最高提取量为0.57%。考虑实验操作的简便性，修正提取工艺条件为提取时间2.5 h、乙醇浓度90%和料液比1∶20(g/mL)。

2.5 优化条件的验证性实验

根据响应面实验优化得出黄花菜黄酮提取的最佳工艺，进行3组平行实验，验证响应面实验结果的可靠性和准确性。验证性实验测定黄花菜黄酮提取量见表4。3组平行样数据的RSD为2.11%，满足要求，得出该提取工艺下黄花菜黄酮提取量较为稳定。

表4 验证性实验测定黄花菜黄酮提取量Table 4 Verification experiment for determining the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni %

2.6 黄花菜黄酮抗氧化性测定

2.6.1 黄花菜黄酮对DPPH自由基清除能力测定

图5 黄花菜黄酮和VC对DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on DPPH free radicals

由图5可知，在测定浓度范围内，VC和黄花菜黄酮清除DPPH自由基的能力逐渐增大，与浓度成一定的量效关系。在0.1 mg/mL处，黄花菜黄酮清除率为82.86%，VC的清除率为95.56%。黄花菜黄酮和VC对DPPH清除率的IC50值分别为0.056 mg/mL和0.021 mg/mL，说明黄花菜黄酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

2.6.2 黄花菜黄酮对ABTS自由基清除能力测定

图6 黄花菜黄酮和VC对ABTS自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on ABTS free radicals

由图6可知，在测定浓度范围内，黄花菜黄酮对ABTS自由基的清除能力逐渐加强，且与VC的变化趋势较一致。在0.1 mg/mL时，黄花菜黄酮清除率达到81.92%，VC清除率为94.77%。黄花菜黄酮和VC对ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，说明黄花菜黄酮具有一定清除ABTS自由基的能力。

3 结论

本文采用索氏提取法，通过单因素实验和响应面实验优化黄花菜黄酮的提取工艺，在提取时间为2.5 h，乙醇浓度为90%，料液比为1∶20(g/mL)时，黄花菜黄酮提取量最大，约为0.55%。由方差分析可知，3个因素及提取时间和料液比的交互项对黄花菜黄酮提取量的影响均极显著(P<0.01)。通过验证实验可得，该工艺下黄花菜黄酮提取量最高，相对标准偏差(RSD)较小，约为2.11%。通过抗氧化性测定可得，黄花菜黄酮和VC对DPPH自由基清除率的IC50值分别为0.056 mg/mL和0.021 mg/mL；对ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，尽管黄花菜黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除率稍弱于VC，但是对其均有一定的清除能力。为今后研究黄花菜黄酮等成分的提取及综合利用提供了实验依据。