SEC23A 在胃癌中的表达及对预后的影响

徐园，虞伟明，张苗尊

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国每年新发病例及死亡病例分别约占全球的44.1%和49.9%[1]。尽管近年来针对胃癌的诊治措施较前大为改善，但我国胃癌的5 年生存率仅为35.1%[2]。因而，寻求胃癌新的治疗靶点，以抑制肿瘤的复发或转移，提高患者生存率意义重大。SEC23 蛋白是外壳蛋白复合物II（COPII）的核心成分，包含5 个不同的结构域（锌指结构域、躯干结构域、-barrel 结构域、-helix结构域和gelsolin结构域），分为2 个亚型（SEC23A 和SEC23B）。SEC23A 位于染色体14q21.1，包含22个外显子，参与COPII的组成[3]，它介导了大多数分泌蛋白从内质网到高尔基体的运输[4]，在影响肿瘤细胞分泌中起重要作用[5]。研究显示SEC23A在前列腺癌[6]、结直肠癌[7]、黑色素瘤[8]等癌症进展中起抑制作用；然而在膀胱癌中则相反，SEC23A 的高表达促进了膀胱癌的进展[9]。但SEC23A 在胃癌中的表达及作用尚未明确，因此本研究探讨SEC23A在胃癌中的表达及对患者预后的影响，为临床提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020 年11 月至2021 年9 月宁波市医疗中心李惠利医院收治的胃癌患者20 例，年龄30 ～86岁；平均54 岁。入选患者均接受了D2根治术，排除术前曾接受过放化疗等患者。本研究经医院伦理委员会及患者和家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生信分析采用生信数据库 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn ）分 析SEC23A在胃癌和非肿瘤样本的表达情况；箱线图和点线图分析并展示SEC23A在胃癌组织和癌旁非肿瘤组织中mRNA 表达情况。采用癌症微阵列数 据 库 Oncomine（http://www.oncomine.org） 分析SEC23A 在胃癌和癌旁非肿瘤组织中的mRNA 表达情况；设定差异倍数1.5 和前10%基因作为阈值，P≤0.05 为有显著差异。

1.2.2 基因芯片 使用TRIZOL 试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）从20对新鲜胃癌和癌旁组织中分离出总RNA。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips（Affymetrix Inc.）确定基因表达谱。经杂交、清洗、染色和扫描。使用MAS 5.0 算法和Gene Spring Software 11.0（Agilent technologies,Santa Clara,CA,US）读取和分析数据。将上调和下调基因的阈值设置为foldchange≥2 或≤0.5。

1.2.3 实时定量PCR 采用Trizol 试剂提取总RNA，再反转录合成cDNA。GAPDH 作为内源性对照。引物序列如下：SEC23A 正义链：5’-AGATGGAGTCCGATTTAGTTGGA-3’；SEC23A 反义链：5’- CAGGTCTCTCTTTCAGTGGTGT-3’；GAPDH 正 义 链：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’；GAPDH 反义链：5’- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；PCR 反应条件如下：94℃5min，扩增40 个循环，94℃变性15s，56℃退火30s，58℃延长30s。全部反应均重复3 遍。采用比较阈值循环（2-CT）方程计算相对表达量，Ct=Ct（目的基因）-C（tGAPDH），Ct=Ct（样本）-C（t对照）；处理后的数据以每个mRNA 的差异倍数表示。

1.2.4 生存分析 借助Kaplan-Meier plotter、GEPIA及Ualcan等不同数据库。目的基因：SEC23A；目标病种：胃癌。Kaplan-Meier plotter 观察指标：总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）、首次进展时间（FP）；GEPIA 观察指标：OS、PFS；Ualcan 观察指标：OS。通过绘制的生存曲线来分析不同SEC23A表达水平与胃癌患者预后之间的关系。P ＜0.05 差异有统计学意义。

1.2.5 基于TCGA 数据库的临床资料分析 通过下载TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）STAD（胃癌）项目中 level3HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 数据和临床数据，用单因素和多因素回归分析评估SEC23A作为胃癌患者预后指标的独立性。纳入的变量包括：T 分期、N 分期、M 分期、病理学分期、年龄、组织分级、SEC23A表达情况。

1.3 统计方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，采用方差分析和独立样本t 检验。数 据 下 载 于 TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）STAD（胃癌）项目中level3HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据，单因素及多因素Cox 回归分析采用R（3.6.3 版本）软件，survival 包用于生存资料的统计学分析。单变量分析中有显著性的因素采用Cox 比例风险模型进行多变量分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SEC23A在不同生信数据库中的表达 GEPIA 数据库显示SEC23A 在胃癌中呈高表达，且显著高于正常组织（P＜0.05）。借助Oncomine 数据库，选取DErrico和Cho两个数据集，进一步分析了SEC23A 在胃癌中mRNA 表达水平。结果表明SEC23A在胃癌中的表达含量显著高于正常组织（P ＜0.05）。

2.2 SEC23A 在胃癌中mRNA 表达水平 基因芯片结果显示SEC23A 在胃癌中的表达是癌旁组织中的2.91 倍（P ＜0.05），见表1。对PCR 结果绘制柱状图，显示SEC23A在胃癌中表达显著高于癌旁非肿瘤织[（0.0534±0.0179）vs（0.0176±0.0139），t=7.043，P ＜0.05）。见图3。

图1 GEPIA数据库中SEC23A在胃癌中的表达情况

图2 Oncomine 数据库中（DErrico 和Cho 两个数据集）SEC23A 在胃癌中的表达情况

图3 RT-PCR 显示SEC23A 在胃癌中的mRNA 表达含量

表1 基因芯片中部分差异基因表达情况

2.3 生存分析及生存曲线图 采用Kaplan-Meier plotter 数据库，分析SEC23A表达与胃癌患者预后之间的关系，发现SEC23A 高表达组OS、PFS、FP 均低于SEC23A 低表达组（均P ＜0.05），见图4。基于GEPIA 数据库，分析SEC23A表达与胃癌患者预后的关系，结果显示SEC23A 高表达组OS、无病生存时间（DFS）显著低于SEC23A 低表达组（均P ＜0.05），见图5。基于Ualcan 数据库，分析SEC23A表达与胃癌患者预后的关系，生存曲线显示SEC23A 低表达的患者具有更好的生存预后，见图6。

图4 KM-plotter 数据库中SEC23A 表达情况与胃癌患者预后之间的关系

图5 GEPIA 数据库中SEC23A 表达情况与胃癌患者预后之间的关系

图6 Ualcan 数据库中SEC23A 表达情况与胃癌患者预后之间的关系

2.4 影响胃癌预后的独立危险因素单因素分析显示，SEC23A 高表达、年龄（＞65 岁）、病理分期（III/IV）、T 分期（T3/T4）、N 分期、M 分期及与胃癌患者OS有关（均P ＜0.05）。多因素分析显示，SEC23A高表达是胃癌预后不良的独立危险因素（HR：1.535，95% CI：1.078 ～2.184，P=0.017），见表2。

表2 SEC23A 和胃癌患者临床病理参数之间的单因素和多因素回归分析

3 讨论

目前，胃癌的治疗手段包括手术、放化疗、靶向治疗及新兴的免疫治疗。手术仍是至今唯一有希望治愈胃癌的方式。在我国，早期胃癌的5 年生存率可达90%以上[10]，但早期诊断率却较低，仅约10%[11]，大多患者一经发现，已是晚期，错过了最佳手术时机，因而我国胃癌的5年生存率较日、韩等国低[12]。积极倡导胃癌的早期筛查、提高胃镜普及率、寻找胃癌有效的治疗手段及发现新的治疗靶点，对提高晚期胃癌患者生存率意义非凡。

COPII是介导大多数分泌蛋白从内质网到高尔基体运输的重要工具[13-14]，SEC23A 参与COPII 的组装。因而，SEC23A被视为分泌蛋白功能的调节因子[10]。研究显示，SEC23A可为多种miRNA 的靶点，通过下调蛋白编码基因的表达而调控细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤转移等[15]，如miR-21 的表达通过靶向和抑制SEC23A 的表达，增强了结直肠癌细胞的增殖和转移[16]；此外，有报道显示SEC23A 是miR-200b 的靶向基因之一，与前列腺癌组织呈负相关[17]。但是，在膀胱癌中，SEC23A 则被报道在膀胱癌中呈高表达，且其高表达是膀胱癌患者预后差的独立危险因素之一[9]。

本研究借助GEPIA 和Oncomine 等不同在线的生信系统，分析SEC23A 在胃癌及非肿瘤正常组织中的表达情况，结果显示SEC23A 在胃癌中的表达升高，显著高于癌旁非肿瘤组织。为了明确SEC23A 在胃癌及癌旁组织中的表达差异，笔者采用基因芯片和qRT-PCR 法加以验证。结果显示SEC23A 在胃癌中的mRNA 水平明显高于非肿瘤正常组织。这证实本研究结果与生信分析结果是相一致的，即SEC23A 在胃癌中高表达。

此外，本研究还借助KM-plotter、Ualcan 等系统分析SEC23A的表达与胃癌患者预后之间的关系。结果显示在SEC23A 高表达的胃癌患者预后明显差于 SEC23A 低表达的患者，这提示SEC23A 高表达时胃癌往往预后不良。同时，本研究通过下载TCGA 数据库中胃癌患者（TCGA-STAD）的临床资料，采用R 语言，作多因素分析显示，SEC23A是影响胃癌预后的独立危险因素之一。以上研究结果均提示SEC23A可能作为提示胃癌预后不良的生物标志物。SEC23A 可能参与了胃癌的发生与发展，当然，本研究尚属初级阶段，仅凭目前研究结果不足以说明这些，仍需进一步研究（体内体外试验等）来证明。但本研究为SEC23A可能成为胃癌潜在治疗靶点提供了新的思路和理论依据，也为更进一步研究提供了相应的基础。