加工番茄系统抗性诱导促生菌的筛选鉴定及其促生防病效果

林 青，史应武，王 娜，华兰兰，杨红梅， 楚 敏，曾 军，高 雁，霍向东

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆大学生命科学与技术学院， 乌鲁木齐 830046；3.新疆师范大学生命科学学院，乌鲁木齐 830054)

0 引 言

【研究意义】加工番茄是新疆特色经济优势产业[1-2]。不同程度改变了种植区生态环境，病虫害发生频繁，制约当地加工番茄种植业的可持续发展[3]。【前人研究进展】早疫病、灰霉病在新疆加工番茄各种植区普遍发生，发病率可达100%，产量损失10%～30%[4]。除加强田间管理外，农药仍然是最广泛的防治选择[5]。化学农药需在植物发病前、发病期多次施用[3]，不仅增加生产成本，对土壤中的有益微生物有影响[6]。有研究已明确了新疆加工番茄早疫病、灰霉病病原菌，并成功筛选到具有较好抑菌性能的拮抗菌，对早疫病有一定防效[7-9]。拮抗菌发挥防治功效依赖于稳定长久的定殖，受植物品种、栽培模式、施用农药、田间生态环境等因素影响，防治效果不稳定[10]。一些促生菌可介导植物发生诱导系统抗性(Induced Systemic Resistance，简称ISR)，对多种真菌、细菌、病毒病害，甚至对一些害虫和线虫产生抗性。与化学防治和拮抗菌功效相比，诱导系统抗性通常具有无污染、广谱性、系统性、非特异性的特点，且不会使病原微生物产生耐药性[11]。【本研究切入点】目前针对诱导新疆加工番茄产生系统抗性的促生菌研究相对较少，筛选系统抗性诱导促生菌，并评价其对早疫病、灰霉病的诱抗效果。【拟解决的关键问题】采用稀释涂布法，分离番茄等作物的根部土壤细菌，利用发芽实验初筛加工番茄促生菌，测量叶片中茉莉酸含量，复筛系统抗性诱导菌株，为新疆加工番茄病害的生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

样品采集：2018年10月15日于新疆生产建设兵团农十二师104团2连蔬菜站(N43°41′15.3″E87°27′34.7″)，采集番茄、辣椒、豆角作物的根及根部土壤，一同放置于灭菌牛皮纸袋，共采集24份样品，冷藏运回实验室进行后续试验。

PDA 培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8，115℃高压灭菌20 min；营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH(7.3±0.1)，121℃高压灭菌15 min；营养肉汤(NB)培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH(7.3±0.1)，121℃高压灭菌15 min。植物茉莉酸(JA)酶联免疫分析 (ELISA)试剂盒：江苏酶标生物科技有限公司；SK8255Ezup柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

早疫病病原菌茄链格孢菌Alternariasolani、灰霉病病原菌灰葡萄孢菌Botrytiscinerea由中国农业大学种子健康中心提供。加工番茄种子新番45号(新红48号)由新疆农业科学院园艺作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 根区、根际土壤细菌的分离纯化

土壤样品制备：根区土为附着在作物根系上抖落下的土。根际土为抖落根系上附着的大量土后根表面仍粘附的少量土壤。按照段佳丽[12]的方法，收集并制备根区、根际土壤悬液。将上述土壤悬液用无菌生理盐水梯度稀释至10-4、10-5和10-6浓度，各取100 μL相应浓度土壤稀释溶液，分别涂布于PDA、NA培养基上，每个梯度3个重复。于28℃培养箱倒置培养3～7 d，及时挑取平板上新长出的单菌落进行纯化、保藏备用。

1.2.2 加工番茄促生菌的筛选

将分离纯化的菌株接种于50 mL NB培养基中，于37℃，摇床转速为180 r/min条件下震荡培养24 h。将菌液用生理盐水稀释至104倍数，菌液浓度为104cfu/mL，用于加工番茄种子浸种。

选取饱满、均匀一致的加工番茄种子，参照赵伟进等[13]方法表面消毒。以无菌生理盐水和稀释至104倍数未接菌的NB培养基为空白对照，将种子分别浸泡于稀释的菌液和对照中，37℃吸附4 h，在超净工作台风干后，放置于铺有用等量无菌水湿润滤纸的培养皿内，每皿10粒种子，每个处理重复3次，于28℃培养箱避光培养，3 d后调查种子的发芽势，测量根长，5 d后调查种子的发芽率，筛选具有显著促生作用的菌株。

1.2.3 诱导加工番茄番系统抗性菌株的筛选

诱导接种：将表面消毒的加工番茄种子点播在装有草炭∶蛭石=2∶1基质的营养钵中，待番茄幼苗长至3叶1心时，挑选长势、株高一致的幼苗。将初筛的促生菌株分别接种于NB培养基中，在37℃，180 r/min条件下摇瓶培养24 h。将菌液于9 000 r/min下离心10 min，弃上清，将沉淀的菌体用清水重悬并调整至浓度为109cfu/mL，用于灌根处理。每钵加工番茄用15 mL重悬菌液灌根，再添加75 mL清水。每钵播种4粒种子，出苗后选取长势一致的幼苗，每钵留2株，每个处理种10钵，重复3次。以清水处理为对照，期间保持每钵浇水量相同。

灌根后采集番茄叶片，每天采集6钵，每株采集1片，将叶片混合分成3份，连续5 d用植物茉莉酸(JA)酶联免疫分析 (ELISA)试剂盒，按说明书操作，测量番茄叶片茉莉酸含量，筛选能显著提高加工番茄茉莉酸含量的菌株。

1.2.4 诱导加工番茄番系统抗性菌株的分子生物学鉴定

通过16S rDNA序列进行菌株鉴定。采用 SK8255Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取菌株 DNA基因组，用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:CGGTTACCTTGTTACGACTTC扩增菌株的16S rDNA。PCR 反应体系：2×Mix 25 μL、27F、1 492R (10 μmol/L) 各1 μL、菌株DNA模板1 μL，加ddH2O至总体积50 μL。PCR反应程序：94℃，5 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，90 s，30次循环；72℃，10 min。PCR 产物由北京鼎国昌盛生物科技有限公司纯化和测序，测得序列经NCBI BLAST比对分析。序列提交GenBank获得登录号。采用 MEGA5 以邻接法(Neighbor Joining)构建系统进化树，bootstrap值1 000。

1.2.5 诱导加工番茄番系统抗性菌株的防病效果验证

对峙实验：将病原菌茄链格孢菌Alternariasolani、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea分别点接于PDA培养基平板中心，将诱导促生菌点接于病原菌四周，置于30℃培养箱培养3～7 d，观察菌株的生长情况。

病原菌制备：将2株病原菌分别接种于装有50 mL PDA培养基的锥形瓶中，每株菌接种10瓶，于28℃培养箱培养7～14 d，待长出孢子，用无菌水在无菌条件下洗脱孢子，血球计数板计数，调整其浓度为106cfu/mL的孢子悬浮液。

诱导接种：方法同1.2.3。

挑战接种：诱导处理5 d后，分别将2种病原菌孢子悬浮液进行叶面喷施，接种后保湿48 h，培养室温度28℃，湿度RH≥90%。挑战接种第5 d和第14 d统计病情指数和诱抗效果。

1.3 数据处理

采用WPS2016进行数据整理和绘图，IBM SPSS Statistics 20进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同作物根区与根际土壤分离细菌

研究表明，分离得到根际土壤细菌91株，根区土壤细菌56株，共计获得 147株细菌。表1

表1 不同作物根际和根区土壤分离细菌数量Table 1 The number of bacteria isolated from rhizosphere and root zone soil of different crops

2.2 加工番茄促生菌的初步筛选

研究表明，加工番茄种子的发芽实验可初步排除非致病菌和筛选促生菌。在147株根际、根区土壤细菌中，共筛选到19株可显著促进加工番茄种子根长，并明显改善发芽率和发芽势的促生菌。其中有7株菌浸种处理的种子根长为清水对照(1.73 cm)的2倍以上，以FY138菌液浸种根最长，为4.37 cm，是清水对照的2.61倍，是NB培养基稀释液对照的1.50倍。FY15、FY10、FY8浸种的种子发芽率是清水对照的2倍以上，是NB培养基稀释液对照的1.47倍以上。FY10等6株菌浸种的种子发芽势是清水对照的1.53倍以上，是NB培养基稀释液对照的1.38倍以上。图1

注：A:加工番茄种子根长；B：加工番茄种子发芽率；C：加工番茄种子发芽势

2.3 加工番茄系统抗性诱导菌株的筛选结果

研究表明，加工番茄幼苗茉莉酸含量会随基质中水分含量的变化而略有波动，呈现出缺水时升高浇水后逐步降低的规律。而诱导菌作用于加工番茄幼苗，植株叶片茉莉酸含量显著提高。FY93作用效果最快，幼苗茉莉酸含量在第2 d即开始上升，第3 d达到峰值，随后下降。FY136作用效果最持久，幼苗茉莉酸含量从第3 d开始逐步上升。FY10、FY12则在第3 d使幼苗茉莉酸含量显著提高，随后下降。在检测期内，各菌株诱导加工番茄幼苗茉莉酸含量上升的峰值，均显著(P<0.05)高于对照各时期。图2

图2 菌株诱导接种后加工番茄幼苗茉莉酸含量Fig.2 Jasmonic acid content of processing tomato seedlings after induction of strains

2.4 加工番茄系统抗性诱导菌株的分子生物学鉴定

研究表明，菌株FY10与BacillusatrophaeusJCM 9070相似性为99.93%，FY12与PseudomonaswadenswilerensisCCOS 864相似性为100%，FY93与BacilluspumilusATCC 7061相似性为99.93%，FY136与BacilluslicheniformisATCC 14580相似性为99.78%，亲缘关系最近。4株菌属于芽孢杆菌属和假单胞菌属，经分子生物学初步将菌株FY10鉴定为萎缩芽孢杆菌Bacillusatrophaeus，菌株FY12鉴定为Pseudomonaswadenswilerensis，菌株FY93鉴定为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus，菌株FY136鉴定为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。图3

图3 基于16SrDNA序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

2.5 诱导菌株的防病效果

2.5.1 加工番茄系统抗性诱导菌株对病原菌的拮抗作用

研究表明，4株诱导菌中，FY10、FY12对早疫病、灰霉病病原菌均产生不同程度的拮抗作用，而FY93、FY136则对2种病原菌无拮抗性。图4

图4 诱导菌株与茄链格孢菌Alternaria solani(A)灰葡萄孢菌Botrytis cinerea(B)的拮抗作用Fig.4 Antagonism of induced strains with Alternaria solani (A) and Botrytis cinerea(B)

2.5.2 加工番茄系统抗性诱导菌株的防病验证效果

研究表明，除FY136外，筛选的诱导株菌均能显著降低加工番茄早疫病、灰霉病的病情指数，在挑战接种14 d分别有27.59%、29.63%以上的诱抗效果，最高达39.44%。而FY136只对灰霉病有显著防效，对早疫病诱抗效果不佳。在发病早期即挑战接种5 d，菌株的诱抗效果至少能达70.57%以上，最高达92.13%。表2

表2 诱导菌株对加工番茄早疫病、灰霉病的诱抗效果Table 2 Inducing effect of induced strains on early blight and gray mold of processing tomato

3 讨 论

植物的诱导系统抗性(ISR)有别于系统获得抗性 (systemic acquired resistance, SAR)[14]，虽然二者都能使植物体在诱导部位以外的非诱导部位获得广谱抗病能力，但前者的作用特点是诱导因子对植物是非致病性的，对病原菌没有直接的杀死或抑制作用，而是通过生物或非生物因子激活植物自身的物理或化学屏障，通过茉莉酸途径产生系统抗性[15]。筛选诱导菌株常注意两点：一是检测诱导菌的非致病性和与病原菌的拮抗性，二是接种时诱导菌和挑战菌在空间上相对隔离，进一步避免菌株拮抗作用造成的抗病性[16]。研究筛选的4株细菌均能显著提高加工番茄幼苗的茉莉酸含量，使植株产生诱导系统抗性，对早疫病(除FY136)和灰霉病有显著的诱抗效果。FY10和FY12还兼具对2种病原菌的拮抗性，其显著的抗病效果也许是菌株诱导植物的系统抗性和对病原菌拮抗的协同增效作用所致。实验中虽使诱导菌株和挑战菌株相对分离，研究表明，一些芽孢杆菌类的生防拮抗菌可产生醇类、酸类、烯烃类、酯类、醛类和酮类等挥发性气体，能有效抑制真菌活性[17]。挥发性物质可通过破坏细胞膜，使菌丝畸形生长，减少孢子囊数目抑制病原真菌生长[18]。GAO等[19]发现，贝莱斯芽孢杆菌 ZSY-1产生的挥发性物质4-氯-3-甲基苯酚对番茄疫病、灰霉病的病原菌有显著的抗菌活性。

花东来等[20]从阿魏根际中筛选分离获得具有ACC脱氨酶活性的PGPR菌株，其菌液对加工番茄种子萌发有促进作用。杨蓉等[9]筛选到2株番茄早疫病菌拮抗菌，拮抗菌发酵液处理的盆栽试验相对防效达35%以上。Zhang等[21]分离到13株细菌，含有多种抗生素生物合成基因，且具固氮、溶磷、抑制病原菌的多种功能。将其中6株菌接种于番茄根部，能有效预防茎腐根腐病并促进番茄生长。

一些促生菌不仅可以促进植物生长，提高作物产量，还能诱导植物产生系统抗性以抵御生物和非生物胁迫[22]。Akhtar等[23]分离的促生菌能在干旱胁迫下提高小麦种子发芽属性，与氧化硅纳米粒子联合应用，通过调节植物的不同生理和代谢过程诱导小麦的耐旱性，提高干旱胁迫下小麦的生长和产量。商业化使用的促生菌BacillussubtilisMBI600[24]对番茄具有较强的定植、促生能力，对3种番茄土传病害有较好的防控效果，转录组学分析表明，接种MBI600增加了番茄水杨酸 (SA) 信号通路、茉莉酸/乙烯信号通路中防御相关基因的转录，发生了系统抗性的诱导。芽孢杆菌GBSC56的挥发物使番茄的植物生长促进基因、防御相关基因的表达量上升，并对南方根结线虫有较高的杀灭活性[25]。Xing等[26]从BacillussimplexSneb545 的培养物中分离出6种诱导系统抗性的化合物，能延缓Sneb545浸种处理的大豆根中大豆孢囊线虫的发育，其中3种化合物在防御大豆孢囊线虫时，诱导参与了水杨酸和茉莉酸途径防御相关基因的表达。

4 结 论

筛选获得3株诱导促生菌，能显著增加加工番茄茉莉酸含量，产生诱导系统抗性，对番茄早疫病、灰霉病有显著防效，诱抗效果在27.59%～39.44%。3株诱导促生菌可显著促进加工番茄种子萌发和增加根长，其中2株菌还能拮抗番茄早疫病、灰霉病病原菌。菌株FY10、FY12、FY93经分子生物学分析鉴定为Bacillusatrophaeus，Pseudomonaswadenswilerensis和Bacilluspumilus。