槲皮素通过上调沉默信息调控因子1减轻心肌梗死后心室重构

陈凯 董静 赵学飞

心肌梗死（心梗）是全球范围内心血管疾病患者死亡的主要原因之一[1]。心室重构是发生于心梗急性期的一种代偿机制，是导致左心室扩张和心力衰竭的主要原因[2-3]。减轻心梗后不良心室重构是改善心梗患者预后的有效途径。沉默信息调控因子1（Sirt1）是一种组蛋白去乙酰化酶。研究发现，外周血中Sirt1 与心室重构程度呈负相关[4]，提示Sirt1在预测和治疗心肌梗死、延缓心室重构等方面具有良好的应用前景。槲皮素（Que）是一种黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、扩张冠状动脉（冠脉）、增加冠脉血流量等生物活性，对癌症、心血管疾病的防治具有重要价值。已有研究证实，Que 可通过上调Sirt1 的表达，降低心肌缺血再灌注微血管的通透性[5]。本研究旨在观察Que 对心梗后心室重构的影响及对Sirt1 的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF 级SD 雄性大鼠60 只，8 周龄，体质量220～250 g。饲养于适宜环境，室温（22±3）℃，湿度50%～70%，12 h/12 h 光/暗循环，标准饲料喂养，自由饮水、进食。动物适应性饲养7 d 后用于实验研究。Que（纯度≥98%）购于上海阿拉丁生化科技公司；Sirt1 抑制剂EX527 购于上海源叶生物公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、Masson 三色染色试剂盒购于碧云天生物技术研究所；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技有限公司；兔抗Sirt1、胱天蛋白酶-3（caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）、微管相关蛋白轻链3（LC3）、Beclin-1、p62 抗体，鼠抗β-actin 抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG 二抗，HRP 标记的山羊抗鼠IgG 二抗购于美国Abcam 公司；增强化学发光反应液购于北京中源合聚生物科技有限公司。

1.2 大鼠心梗模型建立及实验分组

所有大鼠称量并记录体质量，用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开大鼠颈部皮肤，分离气管后行气管插管，连接小动物呼吸机机械通气，于大鼠左胸部皮肤后第4 肋间处横切打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界下方2 mm 处用6-0 手术线穿线结扎左前降支，观察大鼠左心室前壁心肌变苍白，术后24 h 大鼠心电图ST 段弓背向上抬高或T 波高耸表明心梗大鼠模型建立成功。将造模成功的大鼠随机分为心梗组、Que 组、EX527 组、Que＋EX527 组，每组12 只。另取12 只大鼠设为假手术组，假手术组同上述操作，但只穿线不结扎左前降支。术后给予所有大鼠青霉素1 000 U 预防感染。

1.3 给药方法

Que 组大鼠尾静脉注射10 mg/kg Que，EX527组大鼠尾静脉注射1 mg/kg EX527，Que＋EX527组大鼠尾静脉注射10 mg/kg Que 和1 mg/kg EX527，心梗组和假手术组大鼠尾静脉注射同等剂量的生理盐水。每天1 次，连续给药6 周。

1.4 大鼠血流动力学指标测定

末次给药结束12 h 后，称量大鼠体质量，1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离左侧颈总动脉，将内径约1 mm、充有肝素-生理盐水的导管逆行插入左心室，连接四导生理记录仪，稳定20 min 后测量压力曲线，计算左室内压最大上升速率（＋dp/dtmax）、左室内压最大下降速率（－dp/dtmax）、左室收缩压（LVSP）和左室舒张末期压力（LVEDP），同时测量计算平均动脉压（MAP）。

1.5 标本采集和心脏质量参数测定

血流动力学测定后，收集大鼠颈动脉血液样本，3 000 g 离心10 min，分离并收集血清，储存于－80 ℃冰箱中备用。采血结束后，经插管向大鼠左心室推注10%氯化钾溶液2～3 mL，使大鼠心脏停搏于舒张期，迅速打开胸腔取出心脏，用预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称量心脏质量；沿房室环剪去左右心房和右心室，称量左心室（包括室间隔）质量，计算心脏质量指数（HMI）、左心室质量指数（LVMI）。HMI＝心脏质量/体质量，LVMI＝左心室质量/体质量。

1.6 HE染色观察大鼠心肌组织病理形态学变化

大鼠左室心肌组织固定于4%多聚甲醛，常规处理后石蜡包埋，制成厚度为5 μm 的石蜡切片，根据HE 染色试剂盒说明书，用苏木精和伊红染液染色，光学显微镜下观察组织形态学变化。

1.7 Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化

取大鼠石蜡切片，脱蜡至水，用Weigert 氏铁苏木精染液染色10 min，盐水酒精分化10 s，蒸馏水洗1 min，丽春红酸性品红染色5 min，2%冰醋酸水溶液浸洗、1%磷钼酸水溶液分化3 min，苯胺蓝复染5 min，依次水洗、脱水、二甲苯透明，封片后光学显微镜下观察染色结果，其中心肌细胞被染成红色，胶原纤维被染成蓝色。

1.8 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡

取大鼠石蜡切片，脱蜡至水，加入蛋白酶K 溶液消化组织蛋白，磷酸缓冲液（PBS）漂洗后，加入TNUEL 反应液50 μL，37 ℃孵育60 min，加入抗荧光素抗体，DAB 显色，随后苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察细胞凋亡情况，光镜下凋亡细胞核呈绿色，正常细胞核呈蓝色，计算细胞凋亡指数（AI），AI＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.9 Western blot法检测大鼠心肌组织中Sirt1蛋白、凋亡蛋白及自噬蛋白表达

取大鼠左室心肌组织，加入蛋白裂解缓冲液裂解提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。取50 μg 蛋白上样，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到PVDF 膜上，室温下将膜与含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液混合封闭2 h，加入一抗（Sirt1、caspase-3、Bcl-2、Bax、LC3、Beclin-1、p62、β-actin） 稀释液（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（1 ∶3 000）或山羊抗鼠IgG（1 ∶3 000）二抗，室温下孵育2 h，增强化学发光反应液显影，分析蛋白条带图。目的蛋白相对表达量＝目的蛋白条带值/β-actin 条带值。

1.10 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Que改善大鼠心梗后血流动力学指标

与假手术组比较，心梗组大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP均显著降低，LVEDP显著升高（P均＜0.05）；与心梗组比较，Que 组大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 均显著升高，LVEDP 显著降 低（P均＜0.05），EX527组大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP、LVEDP 均无显著变化；与Que 组比 较，Que＋EX527组大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 均显著降低，LVEDP 显著升高（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心梗后血流动力学指标比较（n＝10）

2.2 Que改善大鼠心梗后心脏质量参数

与假手术组比较，心梗组大鼠HMI、LVMI 均显著升高（P均＜0.05）；与心梗组比较，Que 组大鼠HMI、LVMI 均显著降低（P均＜0.05），EX527组大鼠HMI、LVMI 均无显著变化；与Que 组比较，Que＋EX527 组大鼠HMI、LVMI 均显著升高（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心梗后心脏质量参数比较（n＝10）

2.3 Que改善大鼠心梗后心肌组织病理形态学变化

假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，形态结构完整，心肌纤维呈束状排列，结构均匀，细胞间质无明显水肿和结缔组织增生；心梗组和EX527 组大鼠心肌细胞排列紊乱，大量变性坏死，细胞间隙增宽，心肌纤维断裂，细胞间质水肿充血，可见较多结缔组织增生及炎性细胞浸润；Que 组和Que＋EX527 组大鼠心肌细胞排列较为整齐，心肌纤维基本完整，部分心肌纤维断裂，细胞间质水肿减轻，结缔增生组织减少，少量炎性细胞浸润，心肌组织损伤明显减轻，且Que 组大鼠心肌组织损伤改善较Que＋EX527 组明显。见图1。

图1 各组大鼠心梗后心肌组织病理形态学变化（HE染色，×400）

2.4 Que改善大鼠心梗后心肌组织纤维化

假手术组大鼠心肌细胞间质有少量胶原纤维，胶原组织分布较少；心梗组和EX527 组大鼠心肌组织存在大量胶原纤维增生，心肌纤维化严重；Que组和Que＋EX527 组大鼠心肌组织胶原纤维增生减少，心肌纤维化改善，且Que 组大鼠心肌纤维化改善较Que＋EX527 组明显。见图2。

图2 各组大鼠心梗后心肌组织纤维化情况（Masson染色，×100）

2.5 Que抑制大鼠心梗后心肌组织细胞凋亡

与假手术组比较，心梗组大鼠心肌组织AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P均＜0.05）；与心梗组比较，Que 组大鼠心肌组织AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2 的蛋白表达水平显著升高（P均＜0.05），EX527 组大鼠心肌组织AI 及caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平均无显著变化；与Que 组比较，Que＋EX527 组大鼠心肌组织AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表达水平均显著升高，Bcl-2 的蛋白表达水平显著降低（P均＜0.05）。见图3、图4、表3。

图3 各组大鼠心梗后心肌组织细胞TUNEL染色情况

表3 各组大鼠心梗后心肌组织细胞凋亡指数及凋亡蛋白表达水平比较（n＝10）

图4 各组大鼠心梗后心肌组织细胞凋亡蛋白表达情况

2.6 Que上调大鼠心梗后心肌组织中Sirt1蛋白表达并调控自噬蛋白表达

与假手术组比较，心梗组大鼠心肌组织Sirt1 的蛋白表达水平，自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的蛋白表达水平均显著下调，p62 的蛋白表达水平显著上调（P均＜0.05）；与心梗组比较，Que 组大鼠心肌组织Sirt1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表达水平均显著上调，p62 的蛋白表达水平显著下调（P均＜0.05），EX527 组大鼠心肌组织Sirt1 蛋白和自噬蛋白的表达水平均无显著变化；与Que 组比较，Que＋EX527 组大鼠心肌组织Sirt1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表达水平均显著上调，p62的蛋白表达水平显著下调（P均＜0.05）。见图5、表4。

表4 各组大鼠心梗后心肌组织Sirt1蛋白及自噬蛋白表达水平比较（n＝10）

图5 各组大鼠心梗后心肌组织Sirt1蛋白及自噬蛋白表达情况

3 讨论

心室重构是心梗后心力衰竭进展的决定性因素，在缺血性损伤的过程中，缺血心肌和远处非梗死心肌发生进行性左心室重构，包括心肌细胞凋亡、肥大和纤维化等，使得心室功能持续下降，严重影响患者心功能[6-7]。本研究结果显示，心梗后大鼠左心收缩和舒张功能明显受损，表现为心梗组大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 明显下降，LVEDP 明显升高，这与文献报道结果一致[8]。Que 作为一种具有广泛生物活性的天然化合物，被证实在心肌缺血再灌注损伤和心肌梗死等多种心血管疾病中对心肌细胞具有保护作用[9-10]。在本研究中，Que 可以有效改善心梗后左心室收缩和舒张功能，还能够减轻心梗大鼠左心室重构和心肌组织病理损伤，这对于改善心梗后不良预后具有重要意义。

心梗引起心肌组织损伤后，心肌细胞外基质增生，诱导心肌纤维化发生，而心肌纤维化可加重心室重构，降低心脏顺应性，增加心源性猝死风险[11-12]。相关研究报道，血管紧张素受体奈普利蛋白酶抑制剂 LCZ696 通过减少心肌纤维化，减轻心梗后的心脏重构和功能障碍[13]，提示改善心肌纤维化有助于减轻心梗后心室重构。本实验显示，心梗大鼠心肌组织存在大量胶原纤维增生，经过Que 干预后，心梗大鼠心肌组织胶原纤维增生明显减少，表明Que 能够有效抑制心肌纤维化，这与既往研究结果一致[14]。

心肌细胞凋亡是心梗后心室重构的重要机制之一，抑制心肌细胞凋亡可以减轻心室重构，改善心功能。Hou 等[15]报道，心肌细胞二甲基精氨酸二甲胺水解酶1 通过调节细胞内氧化应激水平和细胞凋亡，减轻心梗后左心室重构。Wang 等[16]研究发现，过表达精氨酸甲基转移酶4 可促进心肌细胞凋亡，加重心梗后的心室重构。上述结果均提示心肌细胞凋亡与心梗后心室重构关系密切。本研究结果显示，心梗大鼠心肌组织存在大量细胞凋亡，AI 明显升高，Que 干预显著降低心梗大鼠心肌细胞凋亡，提示Que 可抑制心肌细胞凋亡。Li等[17]研究表明，Que 可以通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 和caspase-3 的水平，抑制心肌细胞凋亡，进而发挥心肌保护作用。本研究进一步检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 和caspase-3 的表达，发现在心梗大鼠模型中，Que 可显著下调caspase-3 和Bax 蛋白表达，显著上调Bcl-2 蛋白表达，证实Que可通过调控凋亡蛋白表达，抑制心梗后大鼠心肌细胞凋亡，进而减轻心梗后心室重构。

自噬是维持细胞内环境稳态的生理过程。多项研究表明，自噬激活可作为适应性机制，应对缺血性心脏病引起的心力衰竭[18-19]。Sciarretta 等[20]报道，海藻糖诱导的自噬激活可改善心梗后的心室重构，提示自噬激活是减轻心室重构和心功能障碍的有效策略。LC3 是自噬体形成的关键蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬呈正相关；Beclin-1 被称为自噬基因，主要作用是调节自噬过程；p62 是自噬选择性底物，自噬-溶酶体通路可调控其降解，该降解过程是通过与LC3 相互作用实现的，p62 表达水平与自噬呈负相关[21]。本研究结果显示，心梗大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 蛋白表达水平明显下降，p62 蛋白表达水平明显升高，而Que 能够显著上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表达水平，显著下调p62 的蛋白表达水平，提示Que 通过激活心梗大鼠心肌细胞自噬，改善心梗后的心室重构。

Sirt1 作为一种去乙酰化酶，可通过调控相应蛋白的去乙酰化，在细胞代谢、细胞凋亡、自噬等生物学过程中发挥重要作用。Luo 等[22]研究报道，Sirt1 通过促进细胞自噬、抑制缺氧诱导的细胞凋亡保护心肌细胞免受缺氧应激的损伤。Pires 等[23]研究结果显示，Sirt1 通过促进真核细胞延伸因子2激酶（eEF2K）/真核细胞延伸因子2（eEF2）依赖的自噬，保护心脏免受内质网应激诱导的损伤，表明Sirt1 通过调控自噬和细胞凋亡保护心肌组织。本研究结果显示，Que 显著上调心梗大鼠心肌组织中Sirt1 的表达水平，提示Que 可能通过调控Sirt1发挥心脏保护作用。因此，本研究采用Sirt1 抑制剂EX527 干预心梗大鼠，结果发现，EX527 显著降低Que 对心梗大鼠心功能、左室重构、心肌损伤、心肌纤维化及心肌细胞凋亡的改善作用，且显著逆转Que 对心梗大鼠心肌凋亡蛋白和自噬蛋白表达的调控作用，提示Que 可能是通过上调Sirt1，激活自噬，抑制凋亡，改善大鼠心梗后的心室重构。

综上所述，本研究证实Que 通过影响Sirt1 表达，调控自噬和抑制凋亡，改善心梗后的心室重构，这为Que 治疗心梗后心室重构提供了依据。