有机肥和钙肥对盐碱土花生根际细菌群落结构的影响

戴良香， 张冠初， 丁红， 徐扬， 张智猛

（山东省花生研究所，山东 青岛 266100）

中国是世界上土地盐碱化面积较大的国家之一，可利用的盐碱地面积达670万hm2，其中，受中、重度盐渍化威胁的低产田约占总耕地面积的22%，主要分布于山东、河北、河南、新疆等光热资源较为丰沛的植棉区，农业开发利用潜力巨大[1-2]。花生是我国重要的油料作物和经济作物，总产量和种植面积分居世界首位和第2位，因其具有耐瘠、固氮、培肥地力和中度耐盐碱等特性，可作为盐碱土区种植业结构调整中较为适宜的替代作物，但较高盐度仍然会严重影响花生的生长和产量[3]。盐碱地花生面积甚少，仅在黄淮海平原的盐渍土、东北松嫩平原盐碱地有较大面积种植。近年来，随着社会经济的发展、植棉效益优势渐失和食用植物油刚性需求，新疆干旱漠境盐土和东部滨海盐碱土区花生产业逐步发展渐成规模优势。

根际是微生物与植物进行交互的界面，是土壤中最活跃的微生物栖息地之一，也是植物获取养分的主要区域。在此微域中，植物-微生物-土壤-环境间相互作用、共同维持着根际微生态系统的平衡，影响作物生产[4-6]，是微生物生态学领域的研究热点之一[7-8]。盐渍土壤对植物生长的抑制主要表现在渗透胁迫和过高盐离子的毒害[9]。Ca可增强植物的抗盐能力[10-11]，其作用机理主要通过抑制钠吸收，促进K、Ca、硝酸根离子的吸收，使Cl-外排；Ca还可促进根瘤发育[12]，提高土壤中自生固氮菌的抗盐能力[13]，因此，增施钙肥对提高盐碱土壤肥力有积极作用。除钙肥外，有机肥可显著改良盐碱地土壤结构、有机质、矿物组成等指标[14-15]，改变土壤微生物群落结构，提高微生物碳源利用率和丰富度[16-18]。

关于盐碱地土壤微生物的研究主要集中在耐盐碱微生物的分离及盐碱极端微生物的生态特征[19-20]、盐胁迫对盐碱地土壤微生物的影响、不同改良措施及植被对盐碱地土壤微生物的影响效果等方面[21]。有关盐碱地花生生产及其耐盐胁迫适应性的研究多集中在人工控制条件下的耐盐花生品种鉴选[2,22-24]、光合产物积累与光合效能变化[25-26]、保护酶活性变化[27]、养分吸收积累、种子际细菌群落变化[28-29]及外源施钙肥的影响等方面。但不同程度盐碱土壤环境下，施用钙肥和有机肥对花生根际微生物组学差异的研究尚未见报道。因此，本研究以黄河三角洲不同盐碱程度的土壤为研究对象，设置外源施用钙肥、有机肥和钙肥有机肥配施处理，研究不同处理下花生根际微生物群落结构的组成及变化，旨在从花生根际细菌群落结构的角度，阐述不同盐碱程度土壤施用有机肥和钙肥对根际细菌菌群的影响及与根际微生物之间的相互作用，阐明土壤-施肥-根际微生物互作的根际生态系统调节机理，为生产上科学施肥提供理论支持和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别采用山东省东营市垦利县汀罗镇毛坨村和垦利县青坨村0—20 cm原状土壤为供试土壤，土壤类型均为盐化潮土，其基本理化性质详见表1。花生材料为山东省花生研究所选育的花育25号（HY25）。

表1 供试土壤样品的理化性状Table 1 Characteristics of soil samples for test

1.2 试验设计

试验于山东省花生研究所试验站防雨棚中进行，选用同批次、同规格塑料盆（底部直径36 cm，高26 cm），将供试土壤风干、过筛（1 cm）后装入塑料盆中，每盆装土20.0 kg。选取饱满均匀的种子，每盆播6粒，播种深度3 cm，出苗后留4株长势一致的幼苗。

试验采用随机区组设计，以不施肥为对照（CK），设置3个施肥处理，分别为施用钙肥（CaO含量）382.5 kg·hm-2（C）；施用有机肥（有机质含量≥45%，三圆肥业生产）2 250.0 kg·hm-2（M）；有机肥、钙肥配施（MC），其中，有机肥用量同M处理，钙肥用量同C处理。每个处理6次重复，均于结荚期（播种后110 d）采用“抖土法”收集紧密附着于花生根系的土壤，以处理为单元进行多点混合样本采集，以盆栽盆为单位混合每盆中植株根际土壤，每3重复根际土壤样品混合为1个生物学样本重复，每处理均获取2个生物学重复，封入灭菌的离心管，置于冰盒带回实验室，保存于-80℃冰箱备用。

将青坨土壤各处理样本用CK1、C1、M1、MC1表示，毛坨土壤各处理样本用CK2、C2、M2、MC2表示。相关测试由北京诺赛基因公司完成。

1.3 土壤DNA提取、16S rRNA文库构建及高通量测序

利用OMEGA土壤总DNA提取试剂盒提取各土壤样品DNA，利用引物340F（CCTACGGGNBGCASCAG）和 805R（GACTACNVGGGTATCTAATCC）对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30个循环；72℃7 min。PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用QIAGEN公司的MinElute胶回收试剂盒进行纯化，最后使用HiSeq2500进行测序。

1.4 生物信息学分析

对测序得到的原始数据（raw data）使用SOAPdenovo进行拼接、过滤，得到有效数据（clean data），基于有效数据进行 OTUs（operational taxonomic units）聚类和物种分类分析，得到每个样品OTUs和分类谱系。再对OTUs进行丰度、Alpha多样性和物种组成聚类分析，采用主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）统计分析，挖掘样品间的物种组成差异，并结合环境因素进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤样本微生物群落测序

各处理根际样本细菌共检测出29个门、79个纲、220个目、348个科、559个属和1 101个种；共获得有效序列数1 334 827条，其中，C1样本有效序列数最多，为194 268.5条，CM1样本有效序列数最少，为152 877.5条。样本序列长度448.32～451.57 bp，平均长度482.0 bp（图1A）。维恩图显示，各处理根际土壤样本共有OTUs数为2 530个；CK1中特有的OTUs数最多，为18个；M1和M2仅7个（图1B）。

图1 花生根际土壤微生物群落测序数据Fig.1 Overall sequence data of bacterial communities in the peanut rhizosphere

2.2 Alpha多样性分析

2.2.1 多样性指数 表2表明，各样本覆盖指数均在0.989 8以上，即均能很好地覆盖各样本微生物组群落的绝大部分物种。各样本Sobs、Chao、Ace丰富度指数均较接近，分别为3 142.5～3400.5、3405.369～3626.337和3350.942～3578.135，其中，M1处理的丰富度指数均较高，M2处理较低；CK1处理的Shannon指数较高；MC2处理的Simpson指数较高。对不同处理的Alpha多样性指数进行比较（图2），M1处理的Sobs、Chao、Ace丰富度指数显著高于CK1、C1、MC1、M2、MC2，但C2和CK2与其他处理间差异不显著；除C1、CK2、MC2处理的Shannon和Simpson多样性指数与其他处理间均无显著差异外，其他处理间均存在显著差异。C1、M1和MC1处理的丰富度指数和多样性指数与CK1处理均差异显著，而CK2与C2、M2和MC2处理间差异不显著。MC2处理的Shannon、Simpson指数与其他处理间均差异不显著。综上所述，施用有机肥、钙肥和二者配施均显著影响较轻度盐碱土壤花生根际微生物的多样性和丰富度，但对较重度盐碱土花生根际细菌的多样性和丰富度无显著影响。

图2 不同处理花生根际土壤微生物的多样性指数Fig.2 Diversity index of rhizosphere soil microorganism in different treatments

表2 不同处理下根际土壤微生物的Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity index of rhizosphere soil samples in each treatment

2.2.2 稀释曲线和Rank-Abundance曲线 Rank-Abundance曲线（图3）表明，当OTU数量小于1 000时，相对丰度迅速下降，表明优势菌群的相对丰度较高、多样性较低；当OTU数量大于2 000时，相对丰度缓慢下降，表明样本中物种多样性较高、分布较为均匀。各处理样本间的曲线变化趋势较为一致，表明不同样本间物种均匀度无显著差异。随测序数据量的增加，物种的丰富度迅速增加，当测序量达到30 000条以上时，OUT水平趋近平缓，即各样本微生物群落测序数据达到饱和，此时能够覆盖花生根际微生物组群落的大部分物种；对不同处理进行比较，C、M和MC处理OTUs数量均差异不显著（图3）。

图3 Alpha多样性分析Fig.3 Alpha diversity analysis

2.3 Beta多样性分析

PCoA显示，第1主成分（PC1）能够解释所有变量方差的52.77%，第2主成分（PC2）可以解释所有变量方差的24.29%，即前2个主成分共解释了总变异的77.06%。各处理样本在PC1和PC2上均存在明显的空间分异，表明土壤盐碱程度、施用有机肥和钙肥影响样本的分布，C1处理的根际微生物菌群结构与其他样本间存在较大差异（图4）。聚类分析（图4）表明，除CM2重复间存在较大差异，其余处理的重复间均聚集在同一分支；而不同处理位于不同分支，表明不同处理样本间差异较大；相同盐碱程度的处理被聚为1个大类，表明2种不同盐碱程度土壤差异较大。

图4 花生根际细菌群落Beta多样性分析Fig.4 Beta diversity analysis of bacterial communities in the peanut rhizosphere

2.4 花生根际微生物群落结构分析

2.4.1 在门、纲水平菌落结构组成 在门、纲水平上，对29个菌门、79个菌纲分别求均值且Others合并门水平＜0.015、纲水平＜0.048，获得Top10菌门/纲（图5）。2种不同盐碱程度土壤根际细菌群落的优势菌门/纲均为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门/纲（Actinobacteria）、unclassified_k_norank_d_Bacteria门/纲、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌 门/纲（Gemmatimonadetes）、α-变 形 菌 纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和Blastocatellia_Subgroup_4菌纲，其相对丰度之和分别为83.86%和60.23%。

图5 门和纲水平各样本的菌落结构Fig.5 Bacterial community at the phylum and class levels in different treatments.

2种盐碱土壤花生根际细菌群落组成受外源施钙肥和有机肥的影响，其优势菌门/纲的相对丰度升高或降低，其中，各处理样本变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度均降低，以C1和M2处理降幅较大，分别降低29.66%和29.03%；施用钙肥后，放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度显著降低，C1和C2处理的降幅分别为24.21%和44.37%，而unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门的相对丰度显著升高，分别为CK的3.5和2.0倍。M1和MC1处理中放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度升高，增幅为16.38%、17.72%，而unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门的相对丰度降低，降幅为15.25%、24.09%；M2和MC2处理unclassified_k_norank_d_Bacteria菌纲相对丰度均显著升高，分别是CK2的1.7和2.1倍。

施用钙肥使α-酸杆菌纲和γ-酸杆菌纲相对丰度均显著降低，其中，C1处理降幅分别为22.50%和34.92%，C2处理降幅为15.87%和14.76%；而unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门的相对丰度则显著升高，C1和C2处理的增幅分别为241.80%和102.72%。M2和MC2处理使α-酸杆菌纲和γ-酸杆菌纲的相对丰度降低25.06%和30.81%。由此表明，施用有机肥显著提高了放线菌门（Actinobacteria）在较重度盐碱土壤花生根际的相对丰度，而降低其在较轻度盐碱土壤花生根际的相对丰度；施用钙肥、有机肥和二者配施均显著提高了较重度盐碱花生根际土壤中unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门/纲的相对丰度，降低变形菌门（Proteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）相对丰度；施钙使较轻度盐碱土壤花生根际unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门的相对丰度提高了2.4倍。

2.4.2 目、科水平菌落结构分析 各处理样本获得220个菌目、348个菌科，分别求均值且Others合并目水平＜0.035、科水平＜0.032，获得Top10菌目/科（图6）。从目、科水平分析，2种不同盐碱程度土壤花生根际微生物群落组成基本相同，其优势菌目/科均为unclassified_k_norank_d_Bacteria、norank_o_norank_c_Subgroup_6、Pyrinomonadaceae和芽单胞菌目/科（Gemmatimonadaceae）4种，但不同施肥处理对两种土壤根际微生物群落相对丰度的影响不同。

施用钙肥均使得两土壤花生根际unclassified_k_norank_d_Bacteria菌科/目的相对丰度显著升高，其中，C1和C2处理的相对丰度分别较其对照升高了2.40和1.02倍；而M2和MC2处理的相对丰度显著升高，分别较其对照升高64.60%和111.04%。C2、M2、MC2处理下Pyrinomonadaceae菌科/目的相对丰度均明显升高，其中，以C2处理增幅最大。M1和M2处理使Propionibacteriales菌科/目的相对丰度分别升高65.31%和269.71%，Nocardioidaceae菌科的相对丰度分别升高66.21%和269.87%（图6）。图6还表明，在目、科水平上，富含大量未能注释的新种OTUs，占总细菌的76.3%～82.5%。说明黄河三角洲滨海盐土花生根际土壤中蕴含着大量的微生物新种资源。

图6 目和科水平各样本细菌的群落结构Fig.6 Bacterial community at the order and famliy levels in different treatments.

2.4.3 在属和种水平菌落结构组成 在所有样品获得的559个属和1 101个种中，各处理求均值后、Others合并属水平＜0.031、种水平＜0.019，得到Top10菌属/种（图7）。

图7 属和种水平各样本细菌群落结构Fig.7 Bacterial community at the genus and species levels in different treatments.

各施肥处理下，2种盐碱土壤花生根际优势菌属/种相同，均为 unclassified_k_norank_d_Bacteria、norank_f_norank_o_norank_c_Subgroup_6、RB41、norank_f_Gemmatimonadaceae，但不同施肥处理对微生物群落的相对丰度影响不同。施用钙肥使unclassified_k_norank_d_Bacteria菌属/种相对丰度显著升高，C1和C2处理的相对丰度分别较其对照升高2.4倍和1.0倍。C2、M2、MC2处理下，RB41菌属/种相对丰度均表现为升高。与目、科类似，在属和种水平上也检测到大量未能注释的新种OTUs，可见黄河三角洲滨海盐土区花生根际微生物具有丰富的多样性。

2.5 16S功能预测分析

KEGG pathway分析表明（图8），在二级分类水平（Level 2），各处理根际微生物菌群富集的功能基因主要包括碳水化合物代谢、全局和总览图以及氨基酸代谢等，且施用钙肥和有机肥均显著提高了碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、翻译和膜运输等功能基因的丰度，其中，以C1和M2处理效果更显著；在三级分类水平（Level 3），各处理均以氨基酸的生物合成及碳代谢相关功能基因丰度最高，其中，C1和M2处理中ABC运输车、核糖体和嘌呤代谢等功能基因过表达。

图8 土壤细菌菌群功能预测Fig.8 The bacterial functional features analysis.

3 讨论

土壤微生物是土壤系统中极其重要且最为活跃的部分，控制着土壤生态系统功能的关键过程，如土壤有机物的降解和矿化、碳氮循环、系统稳定性及抗干扰能力等[30]，被认为是表征土壤质量变化最敏感、最有潜力的指标[31-32]。盐碱土因盐分含量较高，导致微生物数量一般低于普通农田土壤[33-34]。研究表明，盐碱土中的微生物数量与土壤含盐量和碱化度呈显著负相关[21,35-36]；且细菌占绝对优势，其丰度显著高于真菌和放线菌[37-38]。

物种和生境影响植物根际微生物群落结构，环境间的差异是导致花生根际微生物组成差异的主要因素。一定程度的盐胁迫促进了根际细菌群落多样性的维持，而非根际土壤细菌的生长和群落多样性则受到了较为严重的伤害[39]。研究表明，盐渍土植物根际微生物的多样性更高[40]；适当的盐碱胁迫会增加大豆、果树滨梅根际细菌的多样性[39,41]；混合林草生态模式有利于盐碱土壤细菌数量的增加[42]。

不同类型盐碱土壤细菌的群落组成较为相似，但菌群结构和丰度存在一定差异。研究表明，盐碱土根际微生物优势菌群主要为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸 杆 菌 门（Acidobacteria）和 γ-变 形 菌 纲（Gammaproteobacteria）等[43-44]，其中，次生盐碱土细菌群落差异较大，仅γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为共同优势菌群[37]；原生盐碱土中厚壁菌门（Firmicutes）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为优势菌群。墨西哥盐湖周围的盐渍化土壤中，Rhizobia、Flavobacterium相对丰度较高[45]。盐胁迫下花生根际微生物群落的优势菌门不仅包括变形菌门（Proteobacteria）、放线 菌 门（Actinobacteria）和 酸 杆 菌 门（Acidobacteria），还包括 Saccharibacteria、绿弯菌门（Chloroflexi）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）。盐胁迫降低了变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度，但显著提高了蓝藻菌门（Cyanobacteria）的丰度[46]。黄河三角洲滨海盐碱土花生根际微生物的优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）等，其中，Rubellimicrobium、Pontibacter和Lamia的相对丰度明显升高。花生/棉花间作的种植方式对根层土壤微生物优势类群[47]无显著影响。

耐盐植物（芨芨草、柽柳、柳枝稷、苜蓿、枸杞和苦豆子）根际微生物具有相似的群落结构，但丰度存在差异，其中，在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主要优势菌门；在纲水平，芽孢杆菌纲（Bacilli）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和梭菌纲（Clostridia）为优势菌纲，并以芽孢杆菌纲（Bacilli）相对丰度最高[48]。本研究表明，2种不同盐碱程度土壤根际细菌群落中优势菌门/纲均为变 形 菌 门（Proteobacteria）、酸 杆 菌 门（Acidobacteria）、放线菌门/纲（Actinobacteria）、unclassified_k_norank_d_Bacteria门/纲、绿弯菌门（Chloroflexi）和 芽 单 胞 菌 门/纲（Gemmatimonadetes）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌 纲（Gammaproteobacteria）和 Blastocatellia_Subgroup_4菌纲，其相对丰度总和达83.86%和60.23%；与前人研究结果相比，厚壁菌门（Firmicutes）和蓝菌门（Cyanobacteria）的相对丰度较低，仅为0.46%和0.53%，可能与盐碱土类型、植被、利用方式和分析方法等有关。

外源施有机肥对盐碱土壤根际微生物组成和群落结构有明显影响。研究表明，施用糠醛渣、畜禽粪肥和秸秆还田提高了盐渍土壤微生物的Sobs和Shannon多样性指数，但Simpson指数降低，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿弯菌门（Chloroflexi）为优势菌门[49-50]；污水、污泥改良剂改变了滩涂盐渍土壤细菌的群落组成，较低的盐度和碱度、较高的有机质和营养元素更利于细菌的微生境，拟杆菌、变形杆菌、绿弯曲菌、放线菌、酸性杆菌、扁平菌和硬毛菌为优势菌群[51]。本研究中变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌 门（Actinobacteria）、unclassified_k_norank_d_Bacteria门、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等为优势菌门。施用有机肥显著提高了放线菌门（Actinobacteria）在较高含盐量土壤花生根际土壤中的相对丰度，但施用钙肥降低了其在较轻度盐碱土花生根际土壤中的相对丰度。施用钙肥、有机肥和有机肥钙肥配施提高了unclassified_k_norank_d_Bacteria菌门/纲的相对丰度；降低γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）相对丰度，即病原菌的数量显著减少，减轻了病原菌对花生的侵染力。各处理中均有大量OTUs未能注释，说明黄河三角洲滨海盐碱土花生根际蕴含大量微生物新种资源。综上所述，盐碱地施用有机肥和钙肥显著影响根际微生境，对花生根际细菌菌群的结构具有调控作用，但不同盐碱程度下有机肥和钙肥的调控作用存在差异，其差异调控机理有待进一步深入研究。

盐碱土壤的改良与开发是当前研究热点，探讨根际微生物与植物耐盐性间的关系、深入研究植物-土壤-微生物间的相互作用、发掘和开拓耐盐碱微生物资源成为相关研究的重中之重。根际微生物群落功能预测分析表明，优势物种基因主要富集于碳、氨基酸、辅酶和维生素、萜类和聚酮化合物等物质代谢通路[52]。研究表明，信号转导机制、防御机制及翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣等在旱、盐胁迫中活性增强，对花生生长及胁迫应答具有重要意义[46]。施用有机肥和钙肥显著提高了2种盐碱程度土壤细菌碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、翻译和膜运输等功能基因的丰度。未来，可进一步筛选、鉴定具促生能力的嗜盐菌株，基于转录组水平和代谢组水平进一步深入研究微生物的功能，以协调根际土壤有益菌和有害菌的平衡，开发微生物复合菌剂，提高盐碱地作物的抗逆能力和产量。