不同类型甘薯品种遗传多样性的ISSR分析

崔晨珂， 林涛， 安艳波， 崔鹏

（浙江农林大学现代农学院，杭州 311300）

甘 薯（Ipomoea batatasL.）属 旋 花 科（Convolvulaceae），其不仅是重要的粮食，也是重要的饲料工业原料及新型能源作物。我国是甘薯生产大国，产量占世界总产量的67.3%[1]。中国甘薯品种审定专业委员会按照用途将甘薯品种划分为5个类型：食用型、淀粉型、兼用型、特用型和叶菜型。食用型品种注重外观、食味和营养价值，主要用于蒸煮和烘烤加工；淀粉型品种的干率和淀粉含量较高，主要用于淀粉加工；兼用型是指其既可以食用，也可进行淀粉加工和饲料加工；特用型主要是类胡萝卜素和花青素含量较高的品种，主要用于天然色素提取；叶菜型主要以茎尖和幼嫩叶片为蔬菜进行食用和种植[2]；而观赏型是近年来新增加的甘薯分类类型，侧重于其地上部分的颜色和形状，主要用于观赏。随着甘薯产业发展，甘薯分类逐步趋于细化，例如观赏型又可分为观叶型、观花型、观根型、药用观赏型等[3]；鲜食型又可分为鲜食、烘烤、蒸煮和水果型以及薯脯加工型。目前，我国甘薯育种取得了较大进步，已经育成徐薯18、烟薯25、广薯87和心香等优良品种，包括淀粉型、鲜食型、兼用型等类型。但甘薯遗传基础仍非常狭窄,冲绳100和南瑞苕多次作为亲本被应用于杂交育种[4]，这极大地限制了品种遗传改良的发展。因此，利用分子标记研究甘薯品种间的遗传差异,对提高杂种优势利用率具有十分重要的意义。

目前，分析品种遗传多样性常用的分子标记在主要包括 AFLP（amplified fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、SSR（simple sequence repeat）、SRAP（sequencerelated amplified polymorphism)、SNP（single nucleotide polymorphism）和 ISSR（inter-simple sequence repeat）等。Wadl等[5]通过SNP技术对来自8个不同地区419个甘薯品种进行了分析，结果表明，样品遗传多样性与地区差异有关，而地区差异又与种群结构密切相关。Yada等[6]采用405对SSR引物对New Kawogo×Beauregard亲本及其后代采集到133个有效多态性位点，表明SSR适宜甘薯遗传多样性鉴定。Wang等[7]采用EST-SSR标记丰富了甘薯数量和质量性状特性。刘中华等[8]采用SRAP标记在遗传距离为0.18处较好的区分了野生种、地方种和育成品种。此外，还有学者对不同菜用、观赏以及食用甘薯品种进行了遗传多样性分析，均能较好地区分品种间的遗传差异[9-11]。

ISSR具有稳定性好、多态性高、精确度高、通用性强等较多优点。李强等[4]利用ISSR标记对中国甘薯的亲本进行了遗传差异分析，Huang等[12]利用ISSR标记同时分辨了甘薯种间和种内的遗传多样性，表明该标记技术在植物的亲缘关系、甘薯遗传多样性以及系谱关系等方面有很高的分辨力。本研究拟利用ISSR分子标记方法，从品种类型特性角度对来自全国各地的37个不同类型的优良甘薯品种遗传多样性进行分析，判定其亲缘关系的远近，优先选择遗传距离较远的育种亲本可以提高遗传变异的程度，该结果为甘薯杂交育种提供更多的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

37份甘薯品种（表1）的薯块购自相关育种单位，鲜食型品种可溶性糖接近40%；淀粉型品种淀粉含量接近30%；兼用型品种风味口感一般，可溶性糖含量在20%左右，硬度较高。所有材料于2020年3月10日在浙江农林大学平山温室大棚进行常规种植，4月22日采摘新鲜幼嫩甘薯叶片，液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。

表1 37份供试材料的特点和来源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties 续表Continued

表1 37份供试材料的特点和来源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增 采用植物基因组提取试剂盒（Cat.No.3201050，Simgen）提取甘薯叶片DNA。

PCR反应体系：Taq酶Mix（Takara公司）10 μL，ISSR 引 物（10 μmol·L-1）和 模 板 DNA（100 ng·μL-1）分别添加1 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，40个循环；72℃ 7 min，4℃保存。100条ISSR引物[13]由Invitrogen公司合成，其他所用生化试剂购自上海生工生物公司。扩增产物用2%琼脂糖凝胶分离，利用TANON凝胶电泳图象软件拍摄，并分析电泳结果。

1.2.2 数据统计 根据每条引物扩增产物片段的大小进行统计。用数字“1”和“0”分别表示供试材料某一等位基因的有和无，有记为“1”，无记为“0”，用Excel对37份材料的扩增结果建立“1/0”数据库。利用NTsys2.10e软件进行Jaccard（J）遗传相似性系数分析，利用非加权类平均法（unweight pairgroup method using arithmetic averages，UPGMA）构建37个甘薯品种的遗传关系聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记扩增结果分析

引物筛选结果（图1）表明，甘薯品种亲缘关系较近，100条ISSR引物中筛选出19条具有多态性引物。筛选的引物扩增条带清晰，多态性明显，表明ISSR方法能有效的应用于甘薯遗传多样性分析。

图1 引物UBC850对37个品种的扩增带型Fig.1 ISSR-PCR profiles of 37 sweetpotato variety with UBC850 primer

2.2 ISSR标记多态性分析

经统计分析（表2），利用筛选获得的19条引物共扩增出118条带，其中多态性条带115条，多态性位点频率为97.5%。引物UBC821扩增条带数最少，为3条；引物UBC850扩增条带数最多，达8条。19条引物扩增的平均多态性带数为6条，其分子量一般在200～2 000 bp之间。多态性位点频率最低的引物是UBC811和UBC848，为80%，其次是UBC842（83%），其他引物的多态性位点频率均达100%，表明每个品种之间均有多态性差异。

表2 引物序列及扩增结果Table 2 Amplification efficiency of different primers

2.3 聚类结果分析

37份不同甘薯品种中涉及鲜食、淀粉和菜用等共9个类型。虽然薯脯加工型和水果型从广义分类均属于鲜食型，但随着薯类产业分工不断细化，这2种类型已经逐渐成为独立类型。根据ISSR分子标记统计结果，试验涉及甘薯品种的遗传距离介于0.04～0.36之间，平均遗传距离为0.14（图2）。遗传距离0.36处，划分为2类，第1类包含紫罗兰、徐紫薯8号和徐紫薯2号等31个品种，第2类包含秦薯5号和广薯87等6个品种。其中第1类在0.32处，以红东和冀紫薯2号为分界点又分为2个亚类，分别包含紫罗兰等17个和冀紫薯2号等14个鲜食品种。其中，台薯66和红东的遗传距离最近，仅为0.04，二者均属薯脯加工型，商薯19和商薯8号的遗传距离为0.05，均属于淀粉型，红香蕉和烟薯25属于典型的鲜食型甘薯品种，遗传距离也较近，为0.06。观赏型甘薯品种紫罗兰，与花青素加工型徐紫薯8号聚为一类（0.08），二者薯肉均呈紫色，由此可见，ISSR能很好地区分不同类型的甘薯品种。

图2 基于ISSR数据的37份甘薯品种聚类分析结果Fig.2 Clustering analysis of 37 sweetpotato varieties based on the results of ISSR data

2.4 遗传距离分析

根据ISSR聚类分析得出9种类型甘薯的遗传距离（图3），可以看出，花青素加工型与菜用型和水果型的遗传距离最远，分别为0.434和0.401，与观赏型遗传关系最近，距离为0.077，水果型与其他8种类型的遗传关系较远，遗传距离均大于0.300，而鲜食型品种大多适用于蒸煮或烘烤，除与菜用型和水果型的遗传关系稍远之外（分别为0.346和0.368），与其他6种类型的遗传距离均较近。表明鲜食型品种数量较多，其亲本来源类型相对广泛，而菜用型、观赏型和花青素加工型品种数量少，品种亲本类型狭窄。

表3 不同类型甘薯品种间的平均遗传距离Table 3 Mean genetic distances among different types of sweetpotato varieties

3 讨论

甘薯既可以作为粮食作物，也可以是能源和饲料加工原料，使用目的不同，对其品质要求也不同。结合经济性状和营养成分等数据对甘薯品种进行系统分类[14-15]，可以作为亲本选择的依据，但同一类型的不同品种之间还是存在一些差异，不能很好地按用途分类来指导亲本选择。ISSR分子标记进行扩增时不需要知道DNA序列，在引物设计上也比SSR标记更简单[16]，且能揭示比AFLP、RAPD和SSR分子标记更丰富的多态性，现已广泛应用于遗传作图、基因定位、遗传多样性及系统发育等研究领域[1,17]。本研究从甘薯类型分析，37份材料中有鲜食型16份、水果型4份、淀粉型和兼用型各5份、薯脯加工型4份、菜用型和花青素加工型和观赏型各1份，由聚类结果可知，不同类型的甘薯品种均能够各自聚为一类，不同类型甘薯可以明显被区分（图2），表明ISSR分子标记是适用于甘薯资源遗传多样性分析的理想分子标记。

本研究中菜用型和观赏型的遗传距离较远，为0.379，与苏一钧等[3]的研究结果一致。季志仙等[9]通过ISSR分子标记，说明甘薯食用品种间遗传多样性是比较丰富的，本研究中的16个鲜食型品种聚为一类，其遗传距离与其他类型较近，表明其他类型甘薯品种为鲜食型甘薯品种遗传改良与育种创新提供了较好的背景材料。同时，同一类型下的不同品种间遗传距离也较远，表明这些品种资源间存在丰富的遗传多样性[18-20]。此外，本研究中的观赏型品种紫罗兰与花青素加工型品种徐紫薯8号遗传关系最近，且紫罗兰的的亲本不详，推测其二者的亲本来源相似[21]。