北苍术根腐病病原鉴定及生物学特性研究

霍佳欢， 温晓蕾， 李双民， 冯丽娜， 兰淑慧， 董立新，郭思柔， 栗佳宁， 王建华， 齐慧霞*

（1.河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北省作物逆境生物学重点实验室，河北 秦皇岛 066600；2.河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071002；3.河北省昌黎县职业技术教育中心，河北 秦皇岛 066600；4.秦皇岛市植保植检站，河北 秦皇岛 066000）

根腐病是中药材生产上常见的病害之一，由多种病原菌引起，造成根部腐烂，削弱植株对水分和养分的吸收能力，地上部变黄脱落，最后导致全株死亡，严重威胁中药材的生产[1]。据报道，人工栽培红花[1]、黄芪[2]、白及[3]、百合[4]、铁皮石斛[5]、大叶黄[6]等均有根腐病发生，由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、粉红单端孢(Trichothecium roseum)引起；也有少部分是由细菌引起，如三七根腐病由产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indoloqenes)引起[7]。除病原微生物侵染外，土壤湿度过大、栽培地低洼且排水不良、重茬连作以及环境条件恶劣等也是造成根腐病发生的重要原因。

北苍术（Atractylodes chinensis）是一种较珍贵的中药材，主要以干燥的根茎入药，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效[8]。日益增长的需求导致野生北苍术资源严重匮乏，人们开始大面积人工栽培，但由于缺乏专业技术及后期管理措施不当，造成北苍术病害连年发生，且种类繁多。目前，生产上较为常见的有苍术菌核病、叶斑病、黑斑病、炭疽病以及根腐病等[9-11]。根腐病在河北秦皇岛北苍术主产区危害严重，育苗期至成株期均有发生，造成北苍术育苗成活率较低，但造成该病的致病菌尚不明确。本研究在河北省秦皇岛市北仓术主产区采集发病植株，采用结合形态学及分子生物学的方法对该地区病原菌进行了分离及鉴定，明确主要致病菌类型及其生物学特性，以期为合理选用杀菌剂、有效防治该病害提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

北苍术根腐病病害样品采集于秦皇岛市青龙县同盛医药有限公司北苍术种植基地，在河北科技师范学院植物保护实验室开展病害鉴定。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：ddH2O 1 000 mL、马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g。

查氏(Czapek)培养基：ddH2O 1 000 mL、硝酸钠2 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂粉20 g。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离 采用常规组织分离法[12]对采集的病株根系进行分离和纯化。将病株根系用无菌水洗净，在无菌条件下将病健部位交界处剪成2～3 mm小段,用75%乙醇消毒50 s，蒸馏水冲洗2～3次，最后用吸水纸吸干材料表面水分，将其放置在PDA平板上，于25℃恒温培养箱内倒置培养。将纯培养菌落转移到PDA斜面试管中，置于4℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 病原菌形态学鉴定 将分离得到的病原菌接种到PDA培养基上，25℃恒温培养，每天观察并记录菌落形态，在蔡司显微镜下观察其菌丝及分生孢子的形态结构、生长方式等[13]，并拍照记录。依据形态特征[14-17]对病原菌进行初步鉴定。

1.2.3 病原菌分子生物学鉴定 病原菌培养3～4d，将菌丝收集到离心管中，利用试剂盒（NuClean PlantGenomic DNA Kit，康为世纪）提取该病原菌DNA；以ITS1（5’-TCCGTAGGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作为引物进行PCR扩增。PCR总体系25 μL：DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL、Mix 1.5 μL、ITS1和ITS4各1 μL。PCR反应条件：94℃，预变性5 min；94℃变性30 s，5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30次循环。反应结束后，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后进行测序[18]。将获得的序列结果在NCBI数据库中进行blast比对，建立系统发育树，确定北苍术根腐病的病原菌。

1.2.4 病原菌致病性测定及再分离 根据柯赫氏法则［12］，采用离体回接北苍术根系的方式进行致病性测定。取同品种健康的北苍术幼苗根系，去除表面杂物，用75%乙醇进行消毒，采用微伤喷洒1×106cell·L-1孢子悬浮液的方式接种北苍术根系，接种后在25℃恒温培养箱中培养。重复3次，每次接种2株全部根系，每天观察并记录接种材料的发病情况，从接种发病的根部再次分离病菌,完成柯赫氏法则的验证。

1.2.5 适宜生长温度测定 在无菌操作台内将直径为0.8 cm的病原菌菌饼接种到PDA培养基中央，分别放置在5、10、15、20、25、30和35 ℃培养箱中培养，每处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，每天观察菌落变化[5]。

1.2.6 适宜碳源测定 以查氏培养基为基础培养基，分别用等量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、肌醇替换蔗糖制成培养基，在无菌操作台内将直径为0.8 cm的菌饼接种到培养基中央，25℃恒温培养。每处理重复3次，采用十字交叉法测量菌落直径，每天观察菌落变化[5],培养5 d计算菌落平均生长速率[19]。

式中，D为菌落直径；d为培养总天数。

1.2.7 最佳氮源测定 将查氏培养基作为基础培养基分，别用等量的蛋白胨、尿素、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾替换硝酸钠制成培养基，在无菌操作台内将直径为0.8 cm的菌饼接种到培养基中央，25℃恒温培养，每处理重复3次，采用十字交叉法测量菌落直径，每天观察菌落变化[5]，培养5 d计算菌落平均生长速率（式1）。

1.2.8 菌丝致死温度 将直径为0.8 cm的病原菌菌饼转入装有2.5 mL无菌水的试管中，将各试管分别放入40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃水浴锅中，水浴10 min，然后将处理后的菌饼接种到PDA平板中央培养。25℃培养48 h后观察菌丝生长情况，确定致死温度[5]。试验设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 北苍术根腐病病害症状

病株地上部叶片初期从叶缘处褪绿变黄并逐渐向内扩展，后期叶片失水、卷缩、干枯、易碎，发病严重时全株枯死。病株地下部发病不均匀，根系尖端和中上部均可发病，发病初期根系病部颜色呈褐色，变软；后期逐渐变为黑褐色，萎蔫缢缩，随着水分流失根系逐渐干缩、变硬、易折断，病健交接处明显，严重时地下部根系全部变褐腐烂(图1）。

图1 北苍术根腐病症状Fig.1 Symptoms of Atractylodes chinensi root rot

2.2 病原菌形态学特征

经分离纯化获得纯培养菌株，将其命名为CZG-1。在PDA培养基上25℃恒温培养4 d的菌落直径为6.4 cm，菌落外围呈白色，中部为粉紫色，菌落背面有不明显同心圆环；菌丝似绒毛状，气生菌丝生长旺盛，菌丝有隔膜且分支方式表现为侧生分支；分生孢子均无色，大型分生孢子渐尖型镰刀状，有1～5个分隔；小型分生孢子呈卵形，在瓶梗顶端聚成球状，有1～2个分隔，大型分生孢子大小约为(3.3～4.7)×(22.5～62.5)μm;小型分生孢子大小约为(3.2～4.7)×(14.5～19.6)μm，厚垣孢子圆形且无色(图 2)。

图2 北苍术根腐病病原菌形态特征Fig.2 Morphological characteristics of root rot pathogens of Atractylodes chinensi

2.3 病原菌分子生物学鉴定结果

经PCR扩增，北苍术根腐病菌株ITS序列大小为545 bp，将该序列在基因数据库中比对，选择同源性高的菌株序列建构系统发育树，如图3所示。结果表明，CZG-1菌株与序列号为MK849925的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的菌株同源性高达100%。

图3 CZG1菌株ITS序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of CZG1 strain based on ITS sequence

2.4 致病性分析

将菌株接种于健康北苍术幼苗根系后观察发现,接种后1～2 d未表现症状；3 d后根系上生有少量白色菌丝并伴有褐色晕染；4 d后白色菌丝增多，病斑逐渐扩大，发病处颜色呈棕色；5 d后病斑直径达1 cm左右；6 d后病部呈褐色，根尖处开始萎蔫干缩；7 d后菌丝量减少，病部颜色呈深褐色；8 d后病部和健康部位交接处明显；10 d后病部深褐色，根尖、须根大部分已变褐、失水、干枯(图 4)。

图4 北苍术根腐病室内接种发病症状Fig 4 Symptoms of Atractylodes chinensi Root Rot by indoor inoculation

将接种成功的植株根部再次进行病菌分离纯化，均可获得与接种菌株一致的病菌，证明为该病害的致病菌。

2.5 致病菌生物学特性分析

2.5.1 温度对菌丝生长的影响 温度对北苍术根腐病菌的生长影响显著，由图5可知，该病菌在5～35℃条件下均能生长，最佳的生长温度范围在20～30℃，其中在25℃条件下菌落生长最好，培养5 d菌落直径可达到7.80 cm；温度低于5℃或高于35℃时菌落生长十分缓慢，略有菌丝产生。

图5 温度对菌落生长的影响Fig.5 Effect of temperature on colony growth

2.5.2 不同碳源对菌丝生长的影响 北苍术根腐病菌在8种不同碳源培养基上均可生长（表1、图6），病原菌培养前3 d，在以肌醇为基础碳源的培养基上生长最好，菌落直径达4.20 cm，3 d后在葡萄糖和蔗糖为基础碳源的培养基上生长较好，培养5 d后菌落直径分别为6.75和6.70 cm。北苍术根腐病菌对可溶性淀粉的利用率最低，培养5 d后菌落扩展直径为5.38 cm,平均生长速率仅为1.076 cm·d-1，且菌丝生长稀疏。

表1 碳源对菌落直径生长的影响Table 1 Influence of carbon source on the growth of colony diameter

图6 不同碳源对菌落生长的影响Fig.6 Effect of different carbon sources on colony growth

2.5.3 不同氮源对菌丝生长的影响 由表2、图7可知，北苍术根腐病菌在8种不同氮源的培养基上均可生长，菌落生长前2 d，在查氏培养基和牛肉膏培养基上生长较好，培养3 d后在以酵母浸粉为基础氮源的培养基上生长最好，培养5 d菌落直径达7.17 cm,菌落平均生长速率为1.434 cm·d-1;对于硫酸铵和氯化铵的利用率较低,培养5 d菌落直径为3.68和3.53 cm。病原菌在以硝酸钠、牛肉膏、硝酸钾以及蛋白胨为基础氮源的培养基上生长差异不显著，利用率仅次于酵母浸粉。

图7 不同氮源对菌落生长的影响Fig.7 Effect of different nitrogen sources on colony growth

表2 氮源对菌落直径生长的影响Table 2 Influence of nitrogen source on the growth of colony diameter

2.5.4 致死温度分析 由图8可知，40～70℃处理的菌丝均可继续生长，75～85℃处理过的菌丝则停止生长。因此可确定北苍术根腐病菌菌丝的致死温度为75℃。

图8 北苍术根腐病菌致死温度Fig.8 Lethal temperature of Atractylodes chinensi root rot pathogen

3 讨论

本研究采用形态学以及分子生物学相结合的鉴定方法证实了引起秦皇岛地区北苍术根腐病的致病菌为半知菌亚门、镰刀菌属的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，该研究结果与王铁霖等[16]报道的湖北地区茅苍术根腐致病菌一致，由此可推断出尖孢镰刀菌是引起不同地区、不同品种的苍术根腐病的重要致病菌。

尖孢镰刀菌寄主范围广泛，可危害多种作物，通常造成寄主植物发生根腐病或枯萎病[20],寄主不同，尖孢镰刀菌的生长特性也略有差异。该病原菌在25℃下生长良好，不同氮源中，对酵母浸粉利用最高；碳源中对葡萄糖和蔗糖利用率较高。文增叶等[21]、尹乐斌等[22]研究认为尖孢镰刀菌最适生长温度为30℃；曹兴等[3]从百合鳞茎发病部位分离出的尖孢镰刀菌对乳糖的利用率最高，与本研究中尖孢镰刀菌对葡萄糖和蔗糖的利用率较高略有差异；耿丽华等[23]认为尖孢镰刀菌致死温度为68℃；尹乐斌等[22]认为尖孢镰刀菌致死温度为66℃，与本试验中致死温度75℃不同。以上结论说明不同尖孢镰刀菌因生长环境条件差异，其生长特性也略有不同。

北苍术为秦皇岛地区道地药材，对推动当地经济发展具有重要作用，本研究明确了引起本地区北苍术根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌，对生产上有效防控该病害具有指导性意义，但对于该病菌的生理小种、发生流行规律、有效防控技术等还亟待进一步研究，为生产提供进一步的科学指导提供理论支持。