基于网络药理学探究冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用机制

赵建伟 张文贤 林德民 严其凯 王守国 王世杰

[摘要]目的基于網络药理学方法探究冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用靶点及信号通路，探索其作用机制。方法该研究利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）筛选冰清膏的活性成分和中药靶标，使用蛋白质数据库（Uniprot）进行基因名注释，并在基因名片数据库（GeneCards）中检索“深Ⅱ度烧伤创面愈合”的相关疾病靶点，利用Cytoscape 3.8.2软件，构建中药-活性成分-靶点网络，并采用蛋白质相互作用检索数据库（String）构建蛋白质相互作用网络（PPI），利用生物信息分析数据库（DAVID）进行潜在作用靶基因的基因功能富集分析（GO）及通路富集分析（KEGG）。结果筛选出冰清膏146个化合物和191个作用于深Ⅱ度烧伤的蛋白靶点，通过网络拓扑特征评价筛选出25个冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合重要靶点;GO 分析显示富集到生物学过程764个、细胞组分75个、分子功能149个;KEGG 通路富集筛选64条主要通路在促进深Ⅱ度烧伤创面愈合方面具有作用。结论通过网络药理学预测了冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合潜在的作用机制，为进一步的活性成分研究和实验研究提供理论依据。

[关键词]冰清膏;深Ⅱ度烧伤创面愈合;网络药理学;作用机制

[中图分类号] R644  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）09-0023-05

Investigation on the mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healingbased on network pharmacology

ZHAO  JianweiWANG  Shijie1ZHANGWenxianLINDeminYANQikai1WANGShouguo1

1. Clinical College ofTraditional Chinese Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China;

2. Emergency Orthopedics， Gansu Provincial Hospital ofTraditional Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China

[Abstract] Objective The targets， signaling pathways， and their mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healing were explored based on the network pharmacology method. Methods The active ingredients and traditional Chinese medicine targets of Bingqing Ointment were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform. The annotation for gene names was performed with the protein database Uniprot. The related disease targets of "deep second-degree burn wound healing" were searched in the GeneCards database. The TCM-active ingredient- target network was constructed by the Cytoscape 3.8.2 software. The protein-protein interaction was constructed by the protein interactions search database String. Gene ontology （GO） function enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the potential target genes were carried out by using the biological information annotation database DAVID. Results A total of 146 compounds of Bingqing Ointment and 191 protein targets involved in the deep second-degree burn were screened out， and25 important targets of Bingqing Ointment for promoting deep second-degree burn wound healing were screened out based on the evaluation of network topology features. GO analysis showed that 764 biological processes，75 cellular components and 149 molecular functions were enriched.64 major pathways that function in the promotion of deep second-degree burn wound healing were screened by KEGG pathway enrichment analysis. Conclusion This study predicts the potential mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion ofdeep second-degree burn wound healing through network pharmacology， which provides a theoretical basis for further active ingredient research and experimental research.

[Key words] Bingqing Ointment; Deep second-degree burn wound healing; Network pharmacology; Mechanism of action

烧伤一般是指热力因素引起的皮肤组织损伤，另外化学烧伤、辐射灼伤等发生的频率也不断增高[1]。深Ⅱ度烧伤伤及真皮乳头层及部分网状层，较多的组织失活，伤口愈合速度慢，容易引发感染[2]。目前临床治疗烧伤多采用药物及各种物理疗法，虽可取得一定疗效，但创面愈合的效果仍不令人满意。

冰清膏来源于民间验方，由冰片、虎杖、大黄、党参、黄芪、蒲公英、紫草、地榆以及鸡蛋清组成，其功效主要为清热活血、生肌去腐、解毒化瘀。临床试验中，在减轻患者疼痛，促进创面愈合方面有较好的效果（专利号：Z L201711075825.X）。为研究其作用机制，本课题组采用网络药理学方法，挖掘冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的活性成分，预测其作用靶点及相关信号通路，探讨冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用机制，后期通过动物实验进行验证，以期为冰清膏的开发与利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1中药潜在化学成分数据的整理与筛选

在 TCMSP 中以类药性（Drug-likeness， DL）≥0.18筛选冰片、大黄、党参、地榆、虎杖、黄芪、紫草的潜在活性成分。同时通过文献查阅汇总蒲公英与鸡蛋清所有活性成分[3-4]，并通过SwissADME筛选其潜在活性成分。

1.2预测并构建成分靶点集

在 TCMSP 中搜索各活性成分对应的蛋白靶点，去重后获得冰片、大黄、党参、地榆、虎杖、黄芪、紫草的作用靶点。在Uniprot数据库中将上述靶点经基因名称转换。蒲公英与鸡蛋清经筛选成分从 PubChem 数据库中搜集其 SMILE 结构式。利用SwissTargetPrediction数据库预测成分靶点。利用Cytoscape 3.8.2生物信息分析软件构建药物成分-靶点网络图。

1.3深Ⅱ度烧伤的疾病靶点预测

在GeneCards数据库中检索关键词“deep  second degree burn wound healing”，查询与深Ⅱ度烧伤相关的基因，并筛选相关性分数（relevance score）≥1的基因，得到深Ⅱ度燒伤疾病靶点。

1.4冰清膏活性成分与深Ⅱ度烧伤的共同靶点筛选及PPI网络的构建

将冰清膏靶点与深Ⅱ度烧伤靶点进行对比分析，以两者交集作为冰清膏治疗深Ⅱ度烧伤的作用靶点。在 String 网站中导入上述分析获得的基因靶点，把物种设定为“Homo sapiens”，交互作用评分>0.4，获得 PPI 结果。将该结果导入Cytoscape 3.8.2软件中，通过 Analyze Network 进行拓扑分析，并按照自由度（Degree 值）大小筛选关键靶点。

1.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析

通过功能富集分析在线数据库（DAVID）对关键靶点蛋白进行 GO 功能与 KEGG 通路富集分析，另外采用Cytoscape 3.8.2构建冰清膏治疗深Ⅱ度烧伤靶点-KEGG 通路网络图，预测冰清膏对深Ⅱ度烧伤创面愈合的潜在作用机制。

2结果

2.1冰清膏候选化学成分信息及筛选结果

筛选共得到146种活性化学成分，经Uniprot基因名称转化后获得靶点基因，将鸡蛋清、蒲公英的活性成分的结构式导入SwissTargetPrediction获取靶点基因，将所有结果汇总去重后共获得427个作用靶点，采用Cytoscape 3.8.2构建“中药-化学成分-作用靶点”网络图，见图1，网络图中包含9个中药节点，146个化合物节点，427个作用靶点节点和2474条边。其中四边形代表作用靶点，圆形代表中药，六边形代表活性成分。

2.2冰清膏治疗深Ⅱ度烧伤靶点的筛选结果

在GeneCards数据库中筛选出1125个疾病相关靶点，将冰清膏活性成分的预测靶点和深Ⅱ度烧伤相关靶点共同映射，寻找两者共同靶点，结果共获得191个共同靶点。

2.3蛋白质相互作用网络（PPI）的构建和关键靶点筛选

通过 String 网站在线分析得到 PPI 网络，将数据导入Cytoscape 3.8.2后共得到191个节点，4857条边，经拓扑分析后节选 Degree ≥95的靶点作为冰清膏治疗深Ⅱ度烧伤的核心靶点。结果构建的 PPI 网络共有25个节点，199条边，其中色彩越深，节点越大，Degree 值越高，相互作用越密切，见图2。

2.4 GO富集分析与KEGG通路富集分析结果

GO 富集分析显示，生物学过程（biologial process， BP）分析结果764个;细胞组分（cellular component， CC）分析结果75个;分子功能（molecular fuction， MF）分析结果149个。见图3。

KEGG 分析得到130个通路，筛选得到64条与深Ⅱ度烧伤有关的通路。通过微生信网站处理富集分析结果，其中，Y 轴代表通路名称;X 轴代表富集因子;气泡大小代表属于这个通路的目标基因数量，颜色代表富集显著性。见图4。

2.5绘制“中药复方-成分-靶点-通路-疾病”网络图

将 KEGG 分析结果整理后导入Cytoscape 3.8.2绘制“中药复方-成分-靶点-通路-疾病”网络图。包括中药复方1个，成分108个，靶点147个，通路64条，疾病1个。根据 Degree 值由高到低筛选核心成分、靶点以及通路，见图5，图中节点越大、颜色越深其作用越强。

3讨论

本研究借助网络药理学手段，构建冰清膏的“成分-靶点-疾病”生物信息学网络，初步探究该药促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的相关机制。现代药理学研究发现冰清膏中组分主要具有抑菌抗炎、调节微循环、抗氧化、促进免疫功能调节、促进伤口愈合等作用。

本研究筛选得到的冰清膏中108个具有促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的化合物，部分成分的有效性已被证实，根据图5可知槲皮素（MOL000098）、芹菜素（MOL000098）、大黄素（MOL000472）等是关键活性成分。研究显示，槲皮素具有抗炎抑菌及抗氧化等多种生物活性[5]，此外槲皮素可使 IL-1、IL-6、 IL-10等炎症因子的表达量降低[6]，抑制 p38/MAPK 通路相关因子的表达而达到抗炎效果[7]。芹菜素可上调表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）、碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor， b-FCF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表达[8]，能够显著提高抗氧化酶活性并降低 TNF-α、IL-1β、IL-6含量，从而促进深Ⅱ度烧伤创面愈合[9]。大黄素具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、稳定内环境等多种功能[10]，能促进 EGF、 VEGF 表达，皮肤表皮细胞及毛细血管生成，有助于伤口愈合[11]。

蛋白质相互作用网络分析得到的 AKT1、IL-6、 TNF、VEGFA、LI-1β等核心靶点蛋白均与炎症、血管生成、生长因子有关，均被大量研究所证实，这可能是深Ⅱ度烧伤创面愈合的重要作用靶点。AKT1是肿瘤血管成熟、细胞外基质组成和血管生成的关键调节剂，在生长因子和细胞因子的刺激下被激活，是创面愈合过程中血管生成及成熟所必需的成分[12]。IL-6具有促炎和抗炎作用，用以激活免疫反应，尤其是烧伤或其他损伤导致的炎症。TNF-α和 IL-1β会抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）诱导的 p38/MAPK 通络的激活，导致神经生长因子（nerve growth factor， NGF）表达的降低，从而延缓伤口的愈合[13]。 VEGFA 是 VEDF 家族中的一员，具有促进新生血管形成和增加血管通透性的能力。

另外冰清膏候选作用深Ⅱ度烧傷靶基因 KEGG 显著富集通路涉及 TNF 信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、PI3K/AKT 信号通路、MAPK 信号通路等。目前研究表明，TNF 介导了机体内广泛的细胞反应，包括凋亡、炎症、免疫反应等，可引发多种下游通路[14]。HIF-1是与缺氧适应及炎症发展等密切相关的因子，曾勇等[15]研究发现 HIF-1α可以在 p38/MAPK 与 PI3K 的共同作用下上调 VEGF 的表达，从而刺激血管再生，加快创面愈合速度。FoxO参与细胞代谢、增值、迁移、凋亡和血管生成的进展[16]，PI3K/AKT 是FoxO的上游靶点，其具有抑制细胞凋亡，参与控制细胞生长和增殖[17]，还对血管生成有促进作用[18]，李为明等[19]研究显示 PI3K/AKT 通路可以影响 IL-1β、TNF-α与 TGF-β的表达，并下调 HIF-1α使创面愈合得到加速。另外有研究显示 MAPK 信号通路的级联被认为是诱导大鼠烧伤皮肤组织炎症的核心信号通路[20]。各种原因导致 p38/MAPK 的高表达，会诱发炎症因子 TNF-α、IL-1β及 IL-6异常分泌而加重炎症反应。阻断 p38/MAPK 通路活化则会介导全身炎症反应水平更快下降。可以推断出 p38/MAPK 是炎症反应中一条重要通路，在创面愈合也扮演重要角色[21]。因此，冰清膏可能在炎症、细胞生长与增殖、血管生成等方面发挥作用，从而促进深Ⅱ度烧伤创面愈合。

综上所述，本研究利用中药网络药理学的方法，在理论上初步对冰清膏促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用机制进行了系统分析。结果证实了中药治疗疾病多成分、多靶点、多通路的特点，为后续冰清膏进一步的药理机制分析和实验研究提供了理论支持。但中药复方个味中药的剂量，并通过炮制、煎煮等过程，其药效成分发生变化，药理作用也不单是仅通过网络药理学分析就可得出结论，因此，后续需要对本研究结果在药物实验以及临床应用中加以验证。

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（收稿日期：2021-10-12）