小鼠原位肺癌模型构建及在放射治疗研究中的意义

刘振宇,王宏伟

(内蒙古医科大学附属医院放射治疗科,内蒙古 呼和浩特 010050)

WHO、Globcan 2020统计报道2020年肺癌新发病例2206771例，占比约11.4%，是2020年癌症病发率的第二位，而肺癌死亡病例为1796144例，占比约18%，病死率排第一位。尽管手术、放疗、化疗和靶向治疗取得了很大进展，但由于在诊断时大多数患者已局部晚期或出现转移，预后仍然较差，5年生存率仅为15%[1]。医学动物实验是基础实验研究的重要组成部分，更是临床实验及治疗的理论依据和基础。理想的动物模型应该具备动物来源容易、操作简单、定位准确、重复性好、肿瘤组织学类型、生物学特征与人类相近、所需周期较短、移植成功率高等特点。C57BL/6小鼠除了具备上述特点，还有价格低廉、耐受性强、模型成熟、免疫功能正常的优势[2]。小鼠肺脏在生物特性、分子特征方面和人类具有相似性，几乎能找到所有人类同源基因[3]。周足力等[4]用免疫缺陷裸鼠荷人源肺恶性肿瘤的建模成功率是29.65%，肿瘤生长达500 mm3所用平均成瘤时间约32～237 d，该模型虽在临床药物实验及还原人类肺癌基因型发挥了一定作用，但成瘤时间长且成瘤率较低，仍需加以改进以提高临床实用性。为验证原位小鼠肺癌模型的可行性和稳定性，以及在活体实验动物的情况下直观观察肿瘤生长特性及侵袭性，本实验以LLC小鼠肺癌细胞系直接经皮穿刺原位接种于10只C57BL/6小鼠肺内，并以肺部磁共振成像(MRI)的方法直观检验。原位移植模型肿瘤侵袭特征及组织病理学、生物学特性,是一种接近肺癌患者的模型,为肺癌放射治疗等研究提供良好的实验平台。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂与器材：小鼠肺癌细胞系(LLC细胞系)。用“四季青”新生牛血清(批号：19120103)，GE公司DMEM/HIGHGLUCOSE基础培养基(批号：AF29498406),配置含10%血清DMEM/HIGHGLUCOSE基础培养基加1%双抗(100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素)。置于37 ℃、5%CO2混合气体培养箱。水合氯醛溶液、磷酸盐平衡生理盐水溶液(PBS平衡盐液)、0.25%胰酶(GE公司)、培养箱、超净台、荧光显微镜等均由内蒙古农业大学生物科学万方教授团队肿瘤实验室提供。磁共振成像设备及技术支持由内蒙古医科大学第一附属医院影像科提供。

1.1.2 实验动物:无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠，6～8周，雌性，体重约22 g，共10只，实验动物由内蒙古农业大学动物实验室提供，饲养于内蒙古农业大学生命科学院动物实验室SPF级饲养间并进行无菌手术操作。本实验经由内蒙古医科大学科研中心动物实验室批准，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：LLC细胞系经由公司发货干冰运输隔天到，密封完好，给予-80 ℃冰箱保存；隔日复苏，置于含10%血清、1%双抗的DMEM/HIGHGLUCOSE基础培养基中，放于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每天镜下观察细胞生长状态，每2天换液处理，约每3 d进行消化传代一次。细胞汇合率达80%传代培养(图1)。

1.2.2 动物模型的建立：细胞计数板计数及配制2×107个/ml，LLC细胞无血清悬液0.2 ml，在SPF级手术间操作，腹腔注射浓度为4%的水合氯醛溶液麻醉(麻醉用量为小鼠体重的1%)，小鼠右侧卧位，定位于小鼠左侧腋下以碘伏消毒并备皮，再次消毒后行1 cm切口，钝性分离至肋骨表面，可见明显呼吸及肺脏活动，在肋骨上缘1 ml注射器垂直穿刺约3 mm，缓慢注射细胞悬液约50 μl并停留3～5 s迅速拔针，观察数秒是否气胸形成，呼吸如常，碘伏再次消毒以细丝线单纯间断缝合2针。将手术后小鼠放置鼠笼，观察至心肺活动及进食水正常。

2 结 果

2.1 细胞生长情况 体外培养LLC细胞系镜下呈现出梭形，并通过细胞计数板计数发现体外细胞第3天出现快速增长，并且在25 cm2卡瓶中汇合率达80%，可进行1∶2传代培养(图1)。

2.2 动物MRI影像学表现 实验小鼠自移植肿瘤后每7天行MRI扫描，每次MRI参数一致并使用同一线圈。图2为移植第21天后影像学图像示左侧肺内多个边界尚清、混杂信号的不规则肿块影、多层面显示气管及血管受侵征象、纵膈淋巴结融合影，对侧肺脏可见有明显数量不等转移灶，影像信号似人类肺肿瘤显示，未发现肝脏肾脏异常信号影。解剖后证实位置及大小同影像学表现。

图2 移植第21天实验鼠MRI成像

2.3 小鼠生存指标 10只小鼠体重均值在接种细胞约13 d后出现持续下降趋势。小鼠模型在做MRI扫描全部存活，生命状态尚稳定，经麻醉后颈脱处死。

2.4 病理学报告 形态与原代体外细胞形态相似，程长梭形，核幼稚，细胞核深染，核异型性明显，排列杂乱紧密，与邻近肺组织特征完全不同(图3)。

图3 肿瘤组织切片(左图：HE染色×40；右图：HE染色×20)

3 讨 论

3.1 不同肺癌动物模型优缺点 目前常用的肺癌小鼠模型有：化学诱导模型、移植模型、转基因模型等[5]。其中移植模型按移植细胞来源分为鼠源—同种移植模型和非鼠源—异种移植模型，最多来源是人源肺癌细胞；按移植部位可分为原位和非原位，原位模型有经气道移植，经皮移植等，非原位模型最多见为前胸部皮下、背部及腹部皮下等。

化学诱导的肺癌动物模型与移植模型、转基因模型相比，由于其易应用，更接近癌症发生的因果联系，尤其是最接近人类肺癌形成、发展及转移的方案，是研究肿瘤发生发展的最佳选择。另外，有多项研究报道，不同化学物可诱导出不同分型的肺肿瘤[6]。为研究化学诱导的肺腺癌发生的细胞和分子变化，Spella等[7]通过腹腔注射烟草致癌物氨基甲酸酯10周，开发了C57BL/6小鼠肺腺癌模型。NNK用于诱导腺癌[8]。N-亚硝基-三氯乙基脲(NTCU)促进鳞状细胞癌的发展[9]。Mervai等[10]通过在FVB/N小鼠菌株中使用二乙基亚硝胺诱导腺癌，开发了一种新的非小细胞肺癌(NSCLC)动物模型。吴逸明等[11]采用煤-焦沥青(CTP)支气管灌注的方法,诱发大鼠肺癌动物模型。历时实验6个月余仅出现少部分原位肿瘤，时间耗时长，成本大且造模成功率低。随后的研究中鲁植艳[12]改进方法，以改制的 ZY 型12号腰穿针插入左下叶支气管与传统的呼吸道给药方法，对比造模时间明显缩短，成功率明显提高，但相对操作复杂，对实验人员技术水平要求较高。

移植模型中异位移植模型是肺癌实验研究阶段首选的动物模型，由于造模操作简单，对于临床药物开发及药物毒理等研究方面具有不可替代的意义。马雪曼等[13]在进行异位移植与原位移植造模对比研究中得出显著结论，虽然原位移植肿瘤操作难度稍大，但成功率无明显差异，并且原位移植动物模型在其他脏器转移方面的研究有着不可替代的作用。原位移植模型在肿瘤微环境方面研究也具有重要意义。在临床工作中，临床分期为Ⅰ期、Ⅱ期的恶性肿瘤均可以手术完全切除，但很多患者仍因发生转移而致死致残[14]。本次实验小鼠原位肺癌动物模型构建中我们可以观察到肿瘤转移的过程，与人类肿瘤转移方式非常相似，为构建更多脏器的转移瘤模型提供了参考，也为放射治疗开展体内实验研究提供更优平台。文献报道原位移植模型中经气道移植肿瘤，存在明显不足，实验周期长、操作难度大、小鼠手术创伤大，存活期短等问题不可忽略[15]。异种原位移植中，人源异种移植可以很好的体现患者原有肿瘤的生物学特性[4]，是最能体现其肿瘤异质性并且是可以提供患者个性化用药的基础模型。但是，由于人源肺癌移植动物模型应用的实验动物必须是免疫抑制小鼠，在研究免疫药物方面具有一定的局限性。

转基因模型中有代表性的是小鼠小细胞肺癌模型[16]，该模型再现了人类小细胞肺癌的关键特征，包括组织病理学外观，关键神经内分泌标志物的表达和转移扩散模式。佘佐亚等[17]用带有绿色荧光蛋白转基因构建小鼠肺癌模型，虽然22周后得到100%的造模成功率，但表现出明显不足，就是在长时间诱癌过程中,动物早期染毒感染率高，实验动物死亡率高,达到60% (30/50) 。转基因模型从肿瘤进展，以及对不同类型肿瘤的控制都有优势，但综合分析操作难度、生存期、造模周期、个体对肿瘤免疫反应及肿瘤微环境方面，鼠源肺原位移植动物模型是在放射治疗中最佳的选择。

3.2 肺癌原位动物模型的构建及在放射治疗中动物模型的意义 从动物模型的角度出发，近年来有大量研究表明肿瘤细胞对肿瘤微环境的塑造及调节有不可忽略的作用，肿瘤微环境(TME)期初由 Ioannides提出，TME在促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移等方面有显著影响，而且也在对肿瘤细胞自身生长的限制有明显作用[18]。并且贺春艳等[19]研究发现NSCLC组织与癌旁组织对比肺癌基因如缺氧诱导因子-1α(HIF-α)的表达明显升高，并且与肿瘤生长直径等密切相关。岳英等[20]的实验结果得出结论： NSCLC 患者免疫微环境中多种免疫细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、M2型巨噬细胞、PD-L1蛋白参与肿瘤的生长，并促进肿瘤的转移。这有力的表明原位模型可以通过不同分型的恶性肿瘤的肺内移植来构建不同突变基因的肺癌模型，并且模拟TME。同样从肺癌放疗角度出发，原位动物模型与异位模型优势也是很明显的，异位人源肺癌模型是有着人类有相同基因的模型，在化学治疗实验上提供了巨大贡献。但在放疗实践中，不同部位肿瘤的微环境不尽相同，这对放射治疗的疗效有着重要影响，大多数学者认为皮下空间的组织环境中，肿瘤的灌注和氧含量状况与人类肺癌微环境不同。在放疗中肿瘤细胞氧合程度及分次放疗再氧合是至关重要的。有研究表明，在放疗前通过高氧水平预处理多形性成神经胶质瘤(GBM),对辐射抵抗的肿瘤患者放疗是一种安全有效的辅助治疗手段。

3.3 本次肺癌原位动物模型的构建不足、注意事项及改进空间 首先，本次研究中，在种植阶段未进行Matrigel基质胶与细胞悬液混合移植入小鼠肺内，可能是导致较早的肺内转移及肺外(胸膜)转移的原因。其次，对小鼠进行MRI扫描，采用与人体相同的MRI参数设置，对图像质量会有一定影响，如果使用专用小鼠参数会更好；上机过程中由于小鼠负荷肿瘤并麻醉状态对于呼吸与心脏功能的抑制，机房设备环境温度影响导致小鼠状态不佳，表现为呼吸浅慢、心脏搏动幅度减小次数减少，给予电加热设备后小鼠生命状态逐渐明显好转。最后，本实验小鼠解剖后未进行原位移植瘤的肿瘤微环境与皮下异位移植肿瘤微环境的对比研究，进一步研究可能发现皮下肿瘤与原位肿瘤及不同移植肿瘤微环境的不同，在放射治疗中有研究价值。

总之，本研究成功的实现了LLC细胞在C57BL/6小鼠原位肺癌荷瘤模型的构建，并运用MRI直观体现肺内肿瘤存在及生长情况，造模成功率高，为后续开展放射治疗实验研究提供了较为理想的动物模型。但本研究实验动物较少，未观察模型的自然生存期，今后会继续增加动物数量，增加多个实验对照组，对比皮下移植模型及原位移植模型的优缺点，继续优化构建模型方法，改进不足，满足科学实验要求，为放射治疗研究提供最优模型。