替格瑞洛对脓毒血症小鼠高迁移率蛋白1及免疫功能的影响

袁小晶，王 佳

(1.延安市中医医院,陕西 延安 716099；2.西安市中心医院，陕西 西安 710004)

资料显示，脓毒血症在欧洲重症加强护理病房中的发病率高达30%，其病死率高达35%～55%，在美国与恶性肿瘤、心脏病共同被列为三大常见死因[1]。脓毒血症是机体内真菌、细菌或病毒感染诱发的全身炎症反应综合征，是由某种内毒素结合白细胞或内皮细胞引发的炎症反应失控，造成内环境紊乱及全身多器官功能障碍，该病不仅病情危急，且具有较高的病死率[2]。因此，如何有效地治疗脓毒血症，预防疾病进一步进展，对临床具有重要意义。替格瑞洛是新型抗血小板药物，能够缓解大脑缺血再灌注损伤；且对小鼠树突状细胞免疫功能具有抑制作用，可为冠心病的防治提供理论依据[3]。但目前，临床关于替格瑞洛对脓毒血症小鼠高迁移率蛋白1(HMGB-1)及免疫功能影响的研究甚少。基于此，本研究将探讨替格瑞洛对脓毒血症小鼠HMGB-1及免疫功能的影响，以期为临床防治脓毒血症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取100只同月龄健康SPF级BALB/c小鼠，均为雄性，体重(200±20)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司(合格证号：1804033)，实验动物许可证号：SCXK(沪)，2020-0019，饲养于我院动物室，饲养条件为不限水、食物，温度22～26 ℃，湿度50.00%～60.00%，明暗交替12 h/12 h。替格瑞洛(批号：20180226)；美国Abcam公司生产的辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，igG)二抗；美国Invitrogen公司生产的兔抗鼠HMGB-1抗体；美国Santa Cruz公司生产的兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)抗体、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)；武汉碧云天生物科技有限公司生产的白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)；杭州昊鑫生物科技有限公司生产的谷丙转氨酶(Glutamate pyruvate aminotransferase,GPT)；上海康朗生物科技有限公司生产的谷草转氨酶(Glutamate oxaloacetate transaminase，GOT);美国Thermo公司生产的Multiskan Sky High酶标仪；美国贝克曼库尔特有限公司生产的流式细胞仪Cy-tomics FC 500。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备：随机选取80只小鼠制备脓毒血症小鼠模型：进食12 h后，将10%水合氯醛注射入小鼠腹腔进行麻醉，麻醉后，切开腹部将回肠与盲端分离，采用环形结扎盲肠根部(回肠盲端1.5～2.0 cm处)，保持肠道顺畅，肠壁采用针头贯穿穿刺，穿刺2次后将腹腔关闭，在小鼠体内颈皮下注射50 mg/kg生理盐水。

1.2.2 分组及治疗：将20只未制备脓毒血症小鼠模型的小鼠设为空白组，其余制备80只脓毒血症小鼠模型的小鼠依次设为对照组及替格瑞洛低、中、高剂量组，每组20只。其中空白组和对照组在制备模型后12 h灌胃10 mg/kg蒸馏水；替格瑞洛低、中、高剂量组相同时间点灌胃5、10、15 mg/kg替格瑞洛。

1.3 观察指标 ①小鼠存活率：统计各组小鼠存活数量，对小鼠存活率进行计算。②小鼠脾指数：所有小鼠均在术后24 h处死，摘除眼球取血，采集血液2 ml，将其置于FP管内，30 min，离心，速度为3000 r/min，10 min后，保留上清液，保存于-40 ℃冰箱内。采集血液后用脱颈法将小鼠处死，将脾脏摘除，将其保存于液氮中。脾指数根据液氮中保存的脾脏进行计算。脾指数=脾重(mg)/体重(g)×1000。③GPT、GOT水平：取上述保存的血清，GPT、GOT水平采用生化分析仪测定。④免疫功能：取上述保存的血清，CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17细胞、调节性T细胞(Reg-ulatory T cell，Treg)水平采用流式细胞仪检测。⑤Bax、Bcl-2、HMGB-1蛋白表达：将脾组织及血清浓度采用BCA法测定，暗室内曝光显影后，各条带采用自动凝胶成像系统分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠存活率比较 空白组、对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组小鼠存活率依次为100%(20/20)、35%(7/20)、55%(11/20)、60%(12/20)、80%(16/20)，空白组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 各组小鼠脾指数、Bax和Bcl-2蛋白水平比较 空白组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠脾指数、Bax和Bcl-2蛋白水平比较

2.3 各组小鼠GPT、GOT水平比较 空白组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组GPT、GOT水平优于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠GPT、GOT水平比较(U/L)

2.4 各组小鼠免疫功能比较 空白组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠免疫功能比较(%)

2.5 各组小鼠HMGB-1蛋白水平比较 空白组、对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组小鼠HMGB-1蛋白水平依次为(0.19±0.03)、(0.93±0.06)、(0.61±0.04)、(0.39±0.03)、(0.21±0.02)。空白组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

3 讨 论

脓毒血症是一种由病原微生物感染诱发，最终致使机体内多器官功能衰竭的疾病综合征。脓毒血症的发病机制极为复杂，至今尚不完全清楚，可能与机体内的多系统、多器官生理病理改变有关，且可能与组织损害、凝血功能障碍、炎症、感染等相关，已成为临床棘手问题[4]。目前，临床并无行之有效的方法治疗脓毒血症，常采用及时诊断及时对症治疗(辅助治疗包括正性肌力药物治疗、血管升压药物治疗及常规治疗包括血流动力学支持、液体复苏、感染源的控制与预防及抗生素治疗等)以缓解脓毒血症患者的临床症状[5]。近年来，关于脓毒血症的研究较多，但多个新药在动物实验上结果证实疗效较好，但在临床并无取得明显的疗效。替格瑞洛是新一代的ADP受体拮抗剂，属于新型环戊基三唑咪啶类口服抗血小板药物，不需要活化，可逆地、迅速阻断血小板二磷酸腺苷诱导的血小板聚集[6]。以往的研究已证实，替格瑞洛对心肌梗死患者具有较好的疗效，且能够有效治疗糖尿病合并冠心病患者[7-9]。

本研究采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒血症小鼠模型，术后解剖小鼠腹腔发现腹腔内存在腐臭味，可观察到脓液，同时盲肠段结扎部位存在发黑坏死，提示盲肠结扎穿孔法制备脓毒血症小鼠模型成功。动物免疫系统的第一道防线为脾脏，故体现实验动物的特异性免疫与非特异性免疫的最基本指标为脾脏重量，若小鼠的免疫功能减退则脾脏指数则明显降低，且低于正常小鼠[10]。本研究结果显示，空白组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组存活率明显高于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组高于对照组(均P<0.05)，且空白组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组脾指数、Bax、Bcl-2蛋白水平优于对照组(均P<0.05)，提示替格瑞洛可提高脓毒血症小鼠存活率，恢复脾脏重量，降低机体内损伤，发挥保护免疫损伤的功能，且其作用强度与剂量密切相关。

肝肾功能的重要指标包括GPT、GOT水平[11]，本研究结果显示，空白组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组GPT、GOT水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组GPT、GOT水平优于对照组(均P<0.05)，提示替格瑞洛可保护脓毒血症小鼠肝肾功能，从而发挥保护机体内重要脏器的作用，且作用越强则剂量越高。

CD4+属于一类辅助性T细胞，其活化后能够刺激大量细胞因子释放，从而正向调节细胞免疫；而CD8+T细胞又被称为抑制性T细胞，可负向调节细胞免疫作用[12]。另外CD4+T细胞属于重要的Th细胞，CD4+T细胞参与免疫反应的整个过程，根据其分泌的不同细胞因子，可分为2个细胞亚群分别为Th1和Th2,其中Th1主要参与分泌肿瘤坏死因子-α、IFN-γ、IL-2，参与细胞免疫，介导心包毒性T细胞反应，促使免疫应答提高[13]；Th2细胞可参与体液免疫，主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，发挥抑制免疫的作用。当机体内Th2细胞因子占主导地位时，可发生抑制免疫，致使病情加重。Th17细胞是一种可特异性分泌IL-17，但与Th1及Th2的CD4+不同；当机体内发生感染时，可通过分泌IL-17、上调特殊细胞因子、促炎性细胞因子与募集中性粒细胞及集落刺激因子，使其迁移到炎症部位，导致免疫损伤。另外，其分泌的IL-17可介导中性粒细胞动员兴奋，发挥介导前炎症反应的作用[14-15]。Treg细胞具有一群具有抑制免疫作用的细胞群，Treg细胞活化后，可通过转化生长因子-β和免疫抑制因子IL-10的分泌机制，抑制效应T细胞内细胞转导系统的激活，致使效应T细胞活化及增殖抑制。而抑制效应T细胞增殖分化则表示机体陷入免疫抑制状态，致使机体内炎症因子水平降低[16-17]。本研究结果显示，空白组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平优于对照组(均P<0.05)，提示脓毒血症小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平失衡，而替格瑞洛可恢复脓毒血症小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，进而抑制炎症因子，发挥调节机体免疫的作用，作用与剂量密切相关。

HMGB-1主要由巨噬细胞产生非组核蛋白，属于细胞外分子，其水平与巨噬细胞状态密切相关[18-20]。本研究结果显示，空白组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中、高剂量组，替格瑞洛高剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低、中剂量组，替格瑞洛中剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组、替格瑞洛低剂量组，替格瑞洛低剂量组HMGB-1蛋白水平优于对照组(均P<0.05)，提示替格瑞洛可降低脓毒血症小鼠HMGB-1蛋白水平，其通过下调HMGB-1蛋白水平恢复其免疫机制。

综上所述，替格瑞洛可提高脓毒血症小鼠存活率，提高脾指数，降低GPT、GOT水平，避免肝肾功能受损损伤，调节CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，调节免疫功能，其可通过下调HMGB-1蛋白水平恢复其免疫机制，其作用与剂量密切相关。