外周血Leptin、Th17/Treg水平评估溃疡性结肠炎活动度的临床价值

赵成都,胡元元

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性肠道疾病，也是炎性肠病的主要临床表型之一，多见于20～49岁青壮年人群，主要表现为反复发作或持续性腹泻、腹痛、里急后重感及黏液脓血便等，部分患者可出现体重减轻、发热等全身性症状[1]。UC与慢性炎症有关[2]，假如慢性炎症反复发作，则可能增加结直肠的危险，对患者的生活质量和生命安全构成威胁[3]。UC发病有明显的区域差异[4]，多发生在经济高度发达的国家。近年来随着我国经济的不断发展与人们生活方式的改变，其在我国的患病率呈不断上升趋势。目前，UC的发病机制尚未完全阐明，多数研究认为其可能由肠道菌群失调、肠免疫紊乱、基因易感及环境等因素共同作用导致，其中免疫反应尤为重要[5-6]。慢性炎症可能是由于对肠道微生物群或食物抗原的异常免疫反应引起，免疫状态在肠道通透性和屏障功能中发挥关键作用。辅助性T细胞17/调节性T细胞(helper T cells 17 /regulatory T cells，Th17/Treg)是由CD4+T淋巴细胞在不同抗原刺激下分化的不同细胞类型。正常情况下，Th17/Treg处于动态平衡，共同维持体内免疫稳态。据报道，Th17/Treg平衡失调在炎症反应与自身免疫性疾病的发生、发展密切相关[7]。瘦素(leptin，LP)是一种由脂肪组织分泌的激素样细胞因子，可调控食物摄取与能量消耗之间的平衡。研究表明，LP能够直接作用于淋巴细胞进而影响其功能，构成机体免疫应答及防御机制的重要组成部分[8]。目前关于UC患者的外周血LP及Th17/Treg的水平的报道较少，故本研究旨在探讨外周血LP、Th17/Treg水平评估UC活动度的临床价值，以为临床UC的治疗提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究通过钟祥市人民医院伦理委员会批准(批准号：ZXRMYYLL201910DL021)，经所有患者及患者家属同意并签订知情同意书。选取2019年8月至2020年5月到本院就诊的UC患者92例，其中男性45例，女性47例，年龄40～75岁。采用改良Mayo评分系统对UC患者进行分期分组，其中轻度活动(3～5分)组28例，中度活动(6～10分)组42例，重度活动(11～12分)组22例。UC缓解期(≤2分)19例。UC患者入组标准：①UC诊断标准参照中华医学会消化病学分会制定的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》(2018版)[9]，所有患者均符合诊断标准；②胸部X线及尿常规、粪便常规检查无感染；③近一个月内未使用抗生素类药物。排除标准：①合并乙型肝炎病毒、艾滋病毒、丙型肝炎病毒及肠道致病菌等真菌病毒感染者；②心肾功能不全、血液系统疾病、自身免疫性疾病及合并严重脑肺疾病者；③妊娠期及哺乳期患者。另取同时期到本院检查的健康体检者38例作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 LP检测 所有患者均于入院后次日清晨抽取空腹静脉血5 mL，采用肝素抗凝，3 000 r/min离心10 min后分离血清，-80 ℃保存待测。采用酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(武汉默沙克生物科技有限公司)检测LP水平，采用酶标仪(美国Molecular Devices公司)读数。

12.2 Th17细胞检测 所有患者均于空腹状态下采集250 μL全血(经肝素钠抗凝)，加入250 μL含质量浓度为150 g/L胎牛血清的RPMIR 1640培养基(上海远慕生物科技有限公司)及1 μL流式细胞仪(美国贝克曼DxFLEX临床流式细胞仪)刺激阻断剂(美国Pepro Tech公司)重悬细胞，置于条件为37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养4 h。取经刺激后的100 μL全血表面标记抗人 CD8a-FITC(美国Pepro Tech公司)、CD3-APC 抗体(美国Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，分别加入 MEDIUM A液和 B 液，室温孵育 15 min，PBS 清洗 2 次，表面标记抗人 IL-17A-PE 抗体(美国Pepro Tech公司) 4 ℃避光孵育25 min，PBS清洗后重悬待测。

1.2.3 Treg细胞检测 所有患者均于空腹状态下采集100 μL全血(经肝素钠抗凝)标记抗人 CD4-FITC(美国Pepro Tech公司)、CD25-APC抗体(美国Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，加入红细胞裂解液(默克Sigma-Aldric公司)室温 10 min，PBS 清洗2次，固定破膜液(默克Sigma-Aldric公司)4 ℃避光60 min，PBS 清洗2次，标记抗人 Foxp3-PE 抗体(美国Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，PBS 清洗2次。采用 FACS Calibur 进行检测及 Flowjo 7.6 软件进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 五组的临床特征比较

如表1所示，正常对照组、UC缓解组、轻度活动组、中度活动组及重度活动组在年龄、性别、吸烟人数比例、体重指数及病程等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 五组临床资料的比较

2.2 五组的外周血LP、Th17细胞及Treg细胞比例比较

如表2所示，与正常对照组对比，UC缓解期、轻度活动组、中度活动组及重度活动组LP、Th17细胞比例及Th17/Treg均明显增高(P<0.05)，且随病情严重程度的增加不断增高，各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，与正常对照组对比，UC缓解组、轻度对照组、中度活动组及重度对照组的Treg细胞比例水平均明显降低(P<0.05)，且随病情严重程度的增加不断下降，各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 五组的外周血LP、Th17细胞、Treg细胞比例比较

2.3 LP、Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg与Mayo评分的相关性分析

采用Spearman相关性分析，结果显示(表3)LP、Th17细胞及Th17/Treg与Mayo评分呈显著正相关(P<0.05)，Treg细胞与Mayo评分呈显著负相关(P<0.05)；LP与Th17细胞及Th17/Treg呈显著正相关(P<0.05)，与Treg细胞呈显著负相关(P<0.05)。

表3 LP、Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg与Mayo评分的相关性

3 讨论

UC是目前胃肠病治疗中较棘手的难题之一，其病变可发生在结直肠的任何一个或多个部位，临床上以直肠处和乙状结肠处多见，且可累及升结肠甚至整个结肠。当UC患者病变扩散到整个结肠时，可导致末端回肠处(多限于距离盲回瓣10 cm以内的末端回肠)发生病变[10]。在我国UC患者以慢性持续型及慢性复发性为主，当病变局限于直肠时，患者预后良好，病变范围累积多段结肠甚至全结肠时，患者则预后差。UC患者病症较严重的可并发结肠穿孔或大出血，且病程超过十年者，具有较高的癌变率[11]。尽管UC疾病常见且危害患者健康，但其确切的发病机制尚不清楚。

LP是一种由脂肪组织分泌的一种蛋白质类激素，主要由白色脂肪产生，是肥胖基因编码的蛋白产物[12]。LP属于I型细胞因子超家族成员，通过下丘脑上的瘦素受体(Ob-R)的作用，调节下丘脑代谢调节中枢，从而具有控制食欲、增加能量消耗、抑制脂肪合成以及减少能量摄取等作用[13]。在人类中，胃上皮细胞和结肠样本中发炎的粘膜组织中可观察到LP表达，但在正常结肠上皮中未发现LP标记[14]。 研究发现， T淋巴细胞内分布LP受体，LP与之结合能够促进T淋巴细胞活化、增殖及辅助性T细胞分化，进而引发Th17/Treg的激活[15]。在肠道炎症中，LP的作用亦常被认为是由于其对T细胞的调节[14]。研究表明LP拮抗剂增强了粘膜Treg的数量，并减少了小鼠结肠炎模型中黏膜炎性细胞因子的产生[16]。临床研究发现，当UC患者发病时，LP可刺激外周血单个核细胞，产生白介素-1、白介素-6等促炎症因子[17]，进一步增强嗜中性粒细胞浸润及诱导上皮细胞损伤，从而加重肠粘膜的炎症损伤。LP参与肠道的急性和慢性疾病，但其在肠道炎症中的作用有待明确。在本研究中，与正常对照组对比，UC缓解组、轻度对照组、中度活动组及重度对照组外周血LP水平均明显增高，且与UC病情严重程度呈正相关。本研究结果表明，LP可被用于鉴定和评估UC的发生与发展。

综上所述，外周血LP、Th17水平与UC疾病活动度明显呈正相关，Treg水平与UC疾病活动度明显呈负相关，根据上述指标水平可有效评估UC患者疾病严重程度。本研究强调了LP及Th17/Treg在UC发生发展中的重要作用，为指导患者临床诊断和治疗提供重要价值。但本研究临床病例数量有限，结果会有一定程度上的偏差，有待深入研究。此外，本研究发现LP水平和Th17呈同步增加与下降趋势，但二者之间的因果关系在此处未得到证实，需进一步研究探讨UC中LC与Th17/Treg的关系。