LncRNA EIF3J-AS1通过靶向调控miR-597-5p对胃癌细胞增殖、周期分布和凋亡的实验研究

张丽媛，郭舒静，伊雪，石莺

胃癌是我国居民中常见恶性肿瘤，据统计2019年中国胃癌新增病例达61.28万例，死亡病例42.15万例[1]。虽然以手术为基础的综合治疗策略取得了很大进展，但胃癌早期诊断率较低，多数患者在确诊时已处于晚期，现有治疗策略的有效性仍不令人满意[2-4]。近年研究揭示了长链非编码RNA(LncRNA)异常表达和缺失在人类癌症进展中的重要作用，LncRNA可与miRNA特异性结合，抑制其生物学功能，上调靶基因表达，从而影响肿瘤细胞基本生物学行为，参与癌症的发生发展[5-9]。研究指出，LncRNA真核细胞翻译起始因子3J反义RNA1(EIF3J-AS1)在肝癌中表达上调，通过检测LncRNA EIF3J-AS1等6中LncRNA表达对肝癌患者无复发生存期具有预测价值[10]。结直肠癌中LncRNA EIF3J-AS1高表达提示预后较差，沉默LncRNA EIF3J-AS1可促进结肠癌细胞凋亡，抑制细胞增殖[11]。靶基因预测显示miR-597-5p是LncRNA EIF3J-AS1的潜在靶点。已有研究指出miR-597-5p可与circ101555直接结合，沉默circ101555通过上调miR-597-5p表达显著抑制结肠癌细胞增殖和DNA修复能力，并诱导细胞凋亡[12]。然而，目前LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p在胃癌中的表达情况，LncRNA EIF3J-AS1是否靶向miR-597-5p调控胃癌进展未见报道。本研究从细胞增殖、周期分布、细胞凋亡角度分析LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p在胃癌进展中的作用，探讨LncRNA EIF3J-AS1对miR-597-5p的靶向调控作用，旨在为胃癌的早期诊断、分子靶向治疗提供潜在靶标。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

收集2019年1月至2019年12月在我院行手术治疗的37例胃癌患者[男21例，女16例，年龄30～75岁，平均年龄(51.25±4.21)岁]的癌组织和癌旁组织标本。组织离体后，迅速置于液氮中冷冻，后保存在-80 ℃冰箱。入组患者术前均未接受抗肿瘤治疗。本研究经我院伦理委员会批准，并获得所有患者知情同意。

人胃癌组织用液氮在研钵内研磨组织，直至粉末状，1 mL Trizol试剂加入可裂解细胞；胃癌细胞系(SNU-1、AGS、HS-746T)、人胃黏膜细胞GES1购自中国科学院上海细胞库；si-LncRNA EIF3J-AS1、si-NC、miR-NC、miR-597-5p mimics、pcDNA、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1、anti-miR-597-5p、anti-miR-NC、重组荧光素酶报告载体购自上海汉恒生物公司；SYBR Premix EX Taq试剂盒、PrimeScript逆转录试剂盒购自大连宝生物公司；miScript Ⅱ逆转录试剂盒、miScript SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司；CCK-8试剂盒、Cleaved-caspase-3兔多克隆抗体(ab2302)、β-actin兔多克隆抗体(ab8227)购自美国Abcam公司；Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司；CytoFLEX S流式细胞仪为贝克曼库尔特公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p表达

TRIzol法分析组织样本、胃癌细胞系、GES1细胞的总RNA。随后，分别用miScript逆转录试剂盒、PrimeScript逆转录试剂盒合成LncRNA、miRNA的cDNA。再用miScript SYBR Green PCR试剂盒、SYBR Premix EX Taq试剂盒进行RT-qPCR以检测LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p表达。采用2-ΔΔCt法计算基因表达的变化。EI3J-AS1上游引物5′-GCC ACA ATG ATA CAG GTT-3′，下游引物5′-GCC AGT GAC CTG TCC ACC C-3′；β-actin上游引物5′-CGT GAC ATT AAG GAG AAG CTG-3′，下游引物5′-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC-3′；miR597-5p上游引物5′-UGU GUC ACU CGA UGA CCA CUG U3′，下游引物5′-AGU GGU CAU CGA GUG ACA CAU U-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3′，下游引物5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGT C-3′。

1.2.2 转染和实验分组

用不含血清的细胞培养液稀释40 nM的寡核苷酸或2 μg质粒，室温孵育5 min(A液)。同时，用不含血清的细胞培养液稀释5 μL的lipofectamine 2000，室温孵育5 min(B液)。将A液与B液混合，室温孵育20 min(C液)。将2×104个对数期SNU-1细胞接种24孔板，将C液加入60%融合细胞中进行转染。在转染48 h时用RT-qPCR检测基因表达的抑制或促进效果。未转染的SNU-1细胞记为对照组；转染si-LncRNA EIF3J-AS1、si-NC、miR-NC、miR-597-5p mimics、pcDNA、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1、si-LncRNA EIF3J-AS1与anti-miR-NC、si-LncRNA EIF3J-AS1与anti-miR-597-5p的细胞，分别记为si-LncRNA EIF3J-AS1组、si-NC组、miR-NC组、miR-597-5p组、pcDNA组、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1组、si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-NC组、si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-597-5p组。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡

凋亡检测：PBS洗涤转染细胞2次，加入500 μL的1×结合缓冲液(含5 μL Annexin-V-FITC和5 μL碘化丙啶)在室温下避光孵育15 min。1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

周期检测：PBS洗涤转染细胞2次，向细胞悬液中加入预冷70%酒精4 ℃固定过夜。离心除去乙醇，PBS清洗1次，在离心管中留500 μL的PBS，吹散细胞团，加入RNase A工作液，室温避光孵育30 min。离心，用PBS清洗1次，再次离心，加入碘化丙啶，室温避光孵育30 min。混匀，过300目网筛，置于流式管中，4 ℃冰箱保存，待测。流式细胞仪检测细胞周期，Flowjo软件分析数据并导出结果。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力

转染的细胞按照每孔100 μL(3×103个)接种96孔板，孵育48 h后，加入十分之一体积的CCK-8试剂在37 ℃培养箱孵育2 h。用酶标仪在450 nm处检测光密度(OD)值来反映细胞活力。

1.2.5 Western blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达

裂解转染的细胞提取总蛋白，设定电压100 V、时间90 min进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照电流300 mA、时间30 min进行转膜。将膜置于5%脱脂牛奶中封闭2 h，再与一抗在4 ℃下孵育12 h。一抗如下：Cleaved-caspase-3抗体1∶1 500、内参β-actin抗体。然后酶标二抗稀释2 000倍，室温孵育膜1.5 h。化学发光法显影、定影。Image J软件分析Cleaved-caspase-3相对于β-actin条带灰度值以反映其蛋白表达水平。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验

合成包含miR-597-5p结合区域的野生型EIF3J-AS1片段，同时合成不含上述结合区域的突变型EIF3J-AS1片段，将其分别插入pmirGLO荧光素酶载体。将获得荧光素酶报告基因载体WT-EIF3J-AS1和MUT-EIF3J-AS1分别与miR-597-5p mimics、miR-NC共转染SNU-1细胞48 h后，测定细胞相对荧光素酶活性值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 LncRNA EIF3J-AS1和miR-597-5p在胃癌组织、细胞中表达情况

胃癌组织中LncRNA EIF3J-AS1表达水平与癌旁组织比较显著升高(2.23±0.25vs1.00±0.15，t=25.662，P<0.05)，miR-597-5p表达水平与癌旁组织比较显著降低(0.45±0.06vs1.00±0.12，t=24.936，P<0.05)。胃癌细胞系SNU-1、AGS、HS-746T中LncRNA EIF3J-AS1表达水平与人胃黏膜细胞GES1比较显著升高(2.43±0.21，2.05±0.17，1.82±0.14vs1.00±0.10，F=128.339，P<0.05)，miR-597-5p表达水平与GES1细胞比较显著降低(0.40±0.04，0.48±0.03，0.53±0.04vs1.00±0.08，F=250.600，P<0.05)，选择表达差异较大的SNU-1细胞进行功能实验。

2.2 沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1细胞增殖、周期分布、凋亡的影响

si-LncRNA EIF3J-AS1组细胞LncRNA EIF3J-AS1表达水平显著低于NC组(P<0.05)，表明转染si-LncRNA EIF3J-AS1能够抑制LncRNA EIF3J-AS1表达。与NC组比较，si-LncRNA EIF3J-AS1组细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著升高(P<0.05)，细胞活力、S期细胞比例显著降低P<0.05)。见图1、表1。

表1 沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1细胞增殖、周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

图1 沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1细胞周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 A：流式细胞仪检测细胞周期；B：流式细胞仪检测细胞凋亡；C：Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达水平

2.2 过表达miR-597-5p对SNU-1细胞增殖、周期分布和凋亡的影响

miR-597-5p组SNU-1细胞miR-597-5p表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05)，提示转染miR-597-5p mimics可促进miR-597-5p表达。与miR-NC组比较，miR-597-5p组SNU-1细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著升高(P<0.05)，细胞活力、S期细胞比例显著降低(P<0.05)。见图2、表2。

表2 过表达miR-597-5p对SNU-1细胞增殖、周期分布和凋亡的影响

图2 过表达miR-597-5p对SNU-1细胞周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 A：流式细胞仪检测细胞周期；B：流式细胞仪检测细胞凋亡；C：Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达水平

2.4 LncRNA EIF3J-AS1靶向调控miR-597-5p表达

LncBase Predicted v.2预测到miR-597-5p与LncRNA EIF3J-AS1存在特异性结合位点，见图3。过表达miR-597-5p可降低转染WT-EIF3J-AS1的相对荧光素酶活性(P<0.05)，见表3。转染si-LncRNA EIF3J-AS1沉默LncRNA EIF3J-AS1表达后SNU-1细胞miR-597-5p表达水平显著升高(P<0.05)；转染pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1上调LncRNA EIF3J-AS1表达后SNU-1细胞miR-597-5p表达水平显著降低(P<0.05)，见表4。

表3 双荧光素酶报告实验

表4 RT-qPCR检测miR-597-5p的表达

图3 miR-597-5p和LncRNA EIF3J-AS1结合示意图

2.5 抑制miR-597-5p表达可逆转沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1细胞增殖、周期分布和凋亡的影响

与si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-NC组比较，si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-597-5p组SNU-1细胞miR-597-5p表达水平、Cleaved-caspase-3蛋白表达、G0/G1期细胞比例、凋亡率显著降低P<0.05)，细胞活力、S期细胞比例显著升高(P<0.05)。见图4、表5。

表5 抑制miR-597-5p表达可逆转沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影响

图4 抑制miR-597-5p表达可逆转沉默LncRNA EIF3J-AS1对SNU-1周期分布、凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 A：流式细胞仪检测细胞周期；B：流式细胞仪检测细胞凋亡；C：Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达水平

3 讨论

LncRNA不仅参与细胞的增殖、凋亡、转移，还与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移及患者预后相关，是胃癌治疗有吸引力的分子靶点[13-17]。Wei等[18]人指出LncRNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)通过下调miR-1277-5p表达、上调V型胶原蛋白α1表达促进胃癌的生长和转移，LncRNA HOTAIR高表达预示胃癌患者预后不良。Hu等[19]发现LINC00641表达上调与奥沙利铂耐药有关，下调LINC00641通过改变胃癌细胞自噬参与调节奥沙利铂耐药。Chen等[20]报道LINC01234表达增加与胃癌转移、更短生存时间相关，沉默LINC00641可诱导胃癌细胞凋亡和生长阻滞，并抑制裸鼠异种移植瘤形成。本研究检测到LncRNA EIF3J-AS1在胃癌组织和细胞中高表达，并通过体外实验证实沉默LncRNA EIF3J-AS1可抑制胃癌细胞活力，阻滞细胞周期，激活Cleaved-caspase-3，诱导细胞凋亡。LncRNA EIF3J-AS1在肝癌中表达上调，其表达水平与肿瘤大小、血管浸润和肿瘤分期等预后特征相关，敲低LncRNA EIF3J-AS1可抑制缺氧诱导的肝癌细胞增殖和转移[21]。沉默LncRNA EIF3J-AS1通过上调miR-1343-3p表达显著抑制胶质瘤的恶性表型[22]，这与本研究中沉默LncRNA EIF3J-AS1的抗癌作用相似。LncRNA EIF3J-AS1还通过抑制miR-373-3p/ 蛋白激酶B1(AKT1)轴参与调控食管癌细胞生长和转移进程，在食管癌中发挥致癌作用，并可能作为食管癌患者预后生物标志物和潜在治疗靶点[23]。以上研究表明LncRNA EIF3J-AS1在胃癌扮演致癌基因角色，沉默LncRNA EIF3J-AS1通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡来阻碍胃癌进展。

据报道miR-597-5p是胰腺癌的抑癌因子，miR-597-5p通过靶向下调转录因子ELK1显著抑制胰腺癌细胞活力和克隆能力，增加细胞凋亡水平[24]。在结肠癌中miR-597-5p能够影响上皮-间充质转化标志物的表达以及体外迁移和侵袭能力，抑制结肠癌转移[25]。在肝癌中miR-597-5p表达下调，miR-597-5p可通过靶向调控TEAD1 抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[26]。 本研究检测到胃癌组织、细胞中miR-597-5p表达均显著降低，过表达miR-597-5p可激活Cleaved-caspase-3，降低胃癌细胞活力，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。双荧光素酶报告实验显示miR-597-5p为LncRNA EIF3J-AS1的直接靶点。RT-qPCR检测证实，在胃癌细胞中miR-597-5p表达受到LncRNA EIF3J-AS1的负性调控。过表达miR-597-5p和沉默LncRNA EIF3J-AS1在胃癌中的抗肿瘤作用相似，这提示沉默LncRNA EIF3J-AS1的功能是由miR-597-5p表达增加介导的。为证实上述猜想，本研究将si-LncRNA EIF3J-AS1、anti-miR-597-5p共转染胃癌细胞，结果显示抑制miR-597-5p表达可拮抗沉默LncRNA EIF3J-AS1对胃癌细胞活力、周期分布和凋亡的影响，这表明LncRNA EIF3J-AS1靶向miR-597-5p参与胃癌进展。然而，目前的研究仍存在不足之处。例如，LncRNA EIF3J-AS1/miR-597-5p轴的下游靶点和信号通路尚待阐明。此外，还需要通过体内实验和更多的细胞功能实验进一步验证实验结果。

总之，胃癌中LncRNA EIF3J-AS1表达升高，miR-597-5p表达降低。沉默LncRNA EIF3J-AS1通过上调miR-597-5p表达可抑制胃癌细胞增殖，阻碍细胞周期进展，诱导细胞凋亡。这些发现将有助于深入了解胃进展的分子机制，为临床胃癌治疗提供新的分子靶点。