超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇残留量的方法优化

钟名琴 陈彤 丁燕玲 黄婷 何玉榆 谭磊

摘  要：建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇残留量的分析方法。样本经乙腈提取、无水硫酸钠除水后离心，将上层提取液用氮气吹至近干，乙腈溶解后直接经超高效液相色谱-串联质谱仪分析。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在1.00 ng/mL～50.0 ng/mL内具有较好的线性关系，相关系数均为0.999 5;α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的方法检出限分别为9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg;平均回收率分别为81.5%～105.0%和86.7%～97.0%，相对标准偏差分别为4.3%～6.9%和1.8%～5.6%。结果显示该方法灵敏度好，准确度高，操作步骤简单，检测时间大大缩减至2 h，且有效减少了其他方法中用易揮发性无水乙醚提取时出现的乳化现象及对操作人员的伤害，适用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的检测。

关键词：α-玉米赤霉醇;β-玉米赤霉醇;牛奶;超高效液相色谱-串联质谱法

作者简介：钟名琴（1992— ），女，硕士，主要从事农产品及农业投入品监测工作

*通信作者：谭磊，硕士，高级兽医师，主要从事兽药残留检测与风险评估工作;E-mail： 157197202@qq.com

近年来，随着人们生活水平的不断提高，牛奶的销量也不断增加，能为人类提供蛋白质、维生素和钙等营养物质。玉米赤霉醇是人工合成的非类固醇同化性激素，曾被官方批准用于畜牧业生产[1]，用来提高畜禽的饲料转化率[2]，促进它们的生长[3]。然而，农产品在生长期间，饲料和农产品在加工、贮藏、运输过程中，均易造成玉米赤霉醇类药物污染。当给奶牛饲喂受到污染的饲料时，饲料中的玉米赤霉醇等可通过血-乳屏障进入到牛奶中，导致食用牛奶含有玉米赤霉醇类药物，并通过食物链在人体内蓄积，影响和破坏人畜的生长发育及生殖系统等。这不仅会给畜牧业及养殖业造成严重的经济损失，也会对食品安全构成严重威胁，因此已成为各地政府关注的问题。20世纪80年代左右，毒理学研究表明，这类药物会引发癌症。为了防止这些激素随畜产品进入人体，各国陆续颁布法令，禁止在畜牧业生产过程中使用。中华人民共和国农业农村部第250号公告明确规定，在食品生产动物的饲养中禁止使用玉米赤霉醇，所产出的所有可食用动物产品不得检出[4]。

为有效监督牛奶质量安全，建立一种快速、可靠、准确、灵敏的玉米赤霉醇残留量的分析方法具有重要意义。目前，玉米赤霉醇类药物的测定方法有薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）[5]、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunoassay，ELISA）[6]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[7]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]和液相色谱-串联质谱法（liquid chromagraphy-mass spectrometry，LC-MS/MS）等[9-11]，虽然相关文献已报道可用LC-MS/MS测定牛奶中的玉米赤霉醇，但是大多数检测方法存在操作复杂、提取效果差、回收率低的缺点。

本方法优化并建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法来检测牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的残留量。该方法简便可靠、灵敏度好、准确度高，无需经过净化可直接上机测定，有效解决了传统标准方法，例如，GB/T 23218-2008中前处理过程繁琐[12]，易挥发性无水乙醚作为提取试剂具有提取分离效果差、对操作人员身体健康造成较大危害的缺陷，从而为食品安全和人们身体健康提供保障。

1  材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Aglient 1290超高效液相色谱仪、配有电喷雾（ESI）离子源的AB Sciex Triple QuadTM 5500 质谱仪（美国AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自动氮吹仪、IKA旋涡混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS离心机、Milli-Q Integral 3 型超纯水仪、奥特赛斯AS 系列超声波清洗机、CEM PHOENIX微波马弗炉。

1.1.2 药品与试剂

乙腈（色谱纯）、无水硫酸钠（分析纯，使用前需540 ℃烘干8 h）等。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇：纯度高于90.0%，均为德国Dr. Ehrenstorfer公司产品。

1.2 样本制备

取代表性样本约500 g，混匀，装入洁净容器，密封，标记。在抽样及制备的操作过程中，应防止样本收到污染或发生残留物含量的变化。并将试样于0 ℃～4 ℃保存。

1.3 标准储备液和混合标准工作液的配制

准确称取α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的标准品，分别用乙腈溶解并稀释成浓度为1.00 mg/mL的标准储备液，-18 ℃以下冷冻避光保存6个月。再分别移取适量上述各物质标准储备液，用乙腈逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.4 样本前处理

准确称取牛奶样本2.0 g±0.02 g于   50 mL离心管中，加入10 mL乙腈后立即涡旋摇匀，再加入4 g无水硫酸钠，涡旋混匀4 min，超声提取10 min，4 ℃ 9 000 r/min离心8 min，吸取上清液，氮吹近干，用1.00 mL乙腈复溶，过0.22 μm有机相滤膜后，可直接上机测定。

1.5 UPLC-MS/MS条件

1.5.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）;流动相A为纯水;流动相B为乙腈（色谱纯）;柱温40.0 ℃;进样体积5.00 μL。具体梯度洗脱程序见表1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源;扫描方式：负离子扫描;检测方式：多反应监测（multiple-reaction monitoring，MRM）;电喷雾电压： -4.5 kV;离子源温度：500 ℃;气帘气压力：35.0 psi;碰撞气压力：9 psi;雾化器压力：55.0 psi;辅助加热器压力：55.0 psi。

保留时间、定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞能量见表2。

空白基质分别添加10.0 μg/kg α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的色谱图见图1。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

准确称取5个牛奶空白基质样本，按“1.4 样本前处理”的方法处理，获得空白样本提取液。将空白样本基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（质量浓度依次为：1.00 ng/mL、        2.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL）。按方法条件设置仪器参数，待仪器稳定后供超高效液相色谱-串联质谱仪测定，并绘制标准工作曲线。可发现基质试验峰面积与相应回收浓度的线性关系好，其中α-玉米赤霉醇的相关系数为r=0.999 5，β-玉米赤霉醇的相关系数为r=0.999 5，具体见表3。

2.2 方法检出限确定

以空白牛奶样本为基质，做七个平行添加试验，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的阳性添加浓度均为1.00 μg/kg，按照1.4进行前处理，进行上机测定。根据各样本检测值计算出平均值X及标准偏差Sb，按公式检出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（k为置信因子，一般取3;C为理论加标水平，单位为μg/kg）计算，测得α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的方法检出限分别为9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg，见表3。

2.3 方法回收率和精密度验证

用空白牛奶基质样本分别对α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇进行3个不同浓度水平的添加回收实验，每个水平均取6个平行样，阳性添加浓度分别为1.00 μg/kg、2.00μg/kg、10.0 μg/kg。按“1.4 样本前处理”的方法进行处理，处理好的样本供超高效液相色谱串联质谱测定。牛奶样本中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的平均回收率和相对标准偏差结果详见表4。

由表4可知，该方法的回收率较好，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的回收率分别为81.5%～105.0%、86.7%～97.0%，相对标准偏差均小于7.0%，说明该方法重复性好、定性、定量准确，并且峰形受基质的干扰比较小。

3  结论

本方法旨在建立一种牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的超高效液相色谱-串联质谱简便测定方法，为相关监管部门监管快速、准确测定牛奶中该类药物提供方法参考和技术支持。试验结果表明，該方法可以在很大限度上减少样本前处理时间，方法灵敏度及准确度高，提取分离度好。与传统的方法相比，该方法采用乙腈直接提取的方式极大限度提高了检测效率，可适用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇残留量的定性、定量检测。

参考文献

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