血人参提取物及其制剂对半乳糖联合亚硝酸钠致衰老小鼠模型抗氧化能力的影响*

何金英，成 雪，杨 露，缪艳燕，2，张永萍，2，3▲，段 丽

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；4国药集团同济堂(贵州)制药有限公司；贵州 贵阳 550025)

血人参是豆科蝶形花亚科植物茸毛木蓝(IndigoferastaclrvoidesLindl.)的干燥根，为贵州苗族常用药，又名雪人参，《贵州民间方药集》中称为铁刷子，《云南中草药》中称其为红苦刺、山红花。其性温，味微苦涩，有补气摄血、滋阴补肾之功效，主治崩漏、跌打、风湿、肝硬化、痢疾及疳积等[1]。血人参植物主要含有挥发油、黄烷醇、甾醇体类等活性化学成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、抑菌、抗病毒等作用[2-5]，其提取物乙酸乙酯部位也具有较强的抗氧化活性[6]。以血人参为主药的芪胶升白胶囊，由血人参、大枣、阿胶、淫羊藿等中药组成，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗病毒等作用，用于白血病、癌症、肿瘤的治疗[7]。本研究采用D-半乳糖联合亚硝酸钠诱导衰老小鼠的模型进行研究，从抗氧化方面探索苗药血人参提取物、芪胶升白胶囊对机体的抗衰老作用，为血人参及其制剂以后的研究开发及临床应用奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级别KM小鼠，雄性，体重18～22 g，购自重庆腾鑫生物科技有限公司(许可证号：SCXK(军)2012-0011)。

1.2 药物与试剂

血人参乙酸乙酯部位(YSYZ)；芪胶升白胶囊(QJ，贵州德昌祥药业有限公司，批号：25270051)；MDA检测试剂盒(深圳子科生物科技有限公司，批号：20171210)；SOD检测试剂盒(深圳子科生物科技有限公司，批号：20171210)；GSH-Px检测试剂盒(深圳子科生物科技有限公司，批号：20171210)；0.9%氯化钠注射液(贵州科伦药业有限公司，批号：E117081704)；亚硝酸钠(四川金山制药有限公司，批号：170801)；VitE片(汤臣倍健股份有限公司，批号：20160401D)；D-半乳糖(BeiJingsolarbio，Lot-No：0902c052，EXP：20211109)。

1.3 主要仪器

Sorvall ST 40离心机(赛默飞)；ELX800型酶联免疫检测仪(美国GE公司)； tissuelyser-19型组织匀浆机(上海净信科技)；移液器(德国 Eppendorf 公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；水迷宫(中国医学科学院药物研究所研制)。

1.4 小鼠衰老模型建立及药物干预

小鼠适应性饲养7天，进行水迷宫实验，用水迷宫每天训练一次，前5次进行训练，第6次进行筛选，选出能在60 s内找到平台的为合格小鼠，随机分为9组；造模与给药同时进行，正常组每天采用生理盐水皮下注射联合腹腔注射，并用生理盐水进行灌胃；模型组采用皮下注射150 mg·kg-1D-半乳糖联合腹腔注射50 mg·kg-1亚硝酸钠构建小鼠衰老模型[8-11]，阳性对照VitE组造模后灌胃0.75 g·kg-1VE，芪胶升白胶囊高、中、低剂量组造模后分别灌胃2 g·kg-1、1 g·kg-1、0.5 g·kg-1芪胶升白胶囊，血人参乙酸乙酯部位高、中、低剂量组造模后再分别灌胃0.33 g·kg-1、0.17 g·kg-1、0.08 g·kg-1血人参乙酸乙酯部位药液，第7周时进行水迷宫实验，所有样品均溶于生理盐水，连续8周。

1.5 各组小鼠每周体重的测量

在实验期间，每周利用电子天平测量小鼠体重，连续8周。

1.6 各组小鼠脏器指数的计算

小鼠连续8周给药后，通过颈椎脱位方法处死小鼠，分离脏器组织，采用生理盐水冲洗后称其质量，测定脏器指数。小鼠脏器指数=脏器质量/小鼠体质量。

1.7 观察各组小鼠水迷宫实验后潜伏期

造模给药的第7周各组小鼠进行水迷宫实验，试验时将大鼠面向水池壁放入水池中没有躲避平台的象限区域，记录大鼠出水时间(潜伏期)。

1.8 各组小鼠血清及各脏器组织中SOD、GSH-Px活性及MDA水平检测

小鼠连续8周给药后，摘眼球取血，血液经10000 r/min、4 ℃离心10 min，分离血清置于-80 ℃保存，制备肝、心、肾、脑10%的组织匀浆液，1000 r/min，离心10 min后取上清液，采用ELISA法参照试剂盒说明书要求检测血清及各脏器组织中SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 对小鼠体重的影响

实验结果显示，实验前各实验组差异无统计学意义，造模2周后，与正常组比较，模型组小鼠体重减轻，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，除乙酸乙酯高剂量组外，其余实验组小鼠体重增加，差异有统计学意义(P<0.01)。实验4周后，各组小鼠体重增长无明显差异。实验6周，与正常组比较，模型组小鼠体重减轻，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，除乙酸乙酯高剂量组外，其余实验组小鼠体重较大，差异有统计学意义(P<0.01)。实验8周，与正常组比较，模型组与血人参乙酸乙酯部位中剂量组小鼠体重较轻，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各实验组小鼠体重较重，其中乙酸乙酯部位高剂量组、芪胶升白胶囊高低剂量组差异具有统计学意义(P<0.05)。结果如表1所示。

表1 小鼠体重的比较Tab.1 Comparison of the body weight of the mice

2.2 对小鼠各脏器指数的影响

实验结果显示，与正常组比较，各实验组小鼠肝、心、肾、脑、胸腺、脾指数差异无统计学意义。结果如表2所示。

表2 小鼠各脏器指数的比较Tab.2 Comparison of the organ indexes of the mice

2.3 对小鼠学习记忆的影响

实验结果显示，分组时，各组水迷宫实验中潜伏期差异无统计学意义；造模6周后，与正常组比较，模型组小鼠水迷宫实验中潜伏期明显延长(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组、血人参乙酸乙酯部位中低剂量组、芪胶升白胶囊高低剂量组潜伏期明显缩短(P<0.05)。表明血人参、芪胶升白胶囊对D-半乳糖所致的小鼠学习记忆能力降低有一定的抑制作用。结果如表3所示。

表3 小鼠学习记忆能力的比较Tab.3 Comparison of the learning and memory ability of the mice

2.4 对小鼠血清及各脏器组织中SOD活性的影响

与正常组比较，模型组衰老小鼠血清及各脏器组织中SOD活性极显著降低(P<0.01)。与模型组比较，血人参乙酸乙酯部位除脑、肾脏及心脏组织的低剂量组及血清的中、低剂量以外，其余各剂量组血清及脏器组织中的SOD活性极显著提高(P<0.01)；芪胶升白胶囊高、中剂量组能极显著提高衰老小鼠脑、肾脏及肝脏组织中的SOD活性(P<0.01)，同时高剂量组能极显著提高血清与心脏组织中的SOD活性(P<0.01)，中剂量组能显著提高心脏组织中的SOD活性(P<0.05)。与阳性药VitE组比较，血人参乙酸乙酯部位除血清与脑组织中、低剂量组以及心脏与肝脏低剂量组外，其余各剂量组均极显著提高血清与心脏组织中的SOD活性(P<0.01)；芪胶升白胶囊高、中剂量组均能极显著提高脑组织、肾脏及肝脏组织中的SOD活性(P<0.01)，芪胶升白胶囊高剂量组能极显著提高血清中的SOD活性(P<0.01)，芪胶升白胶囊高、中、低剂量组分别能显著提高心脏、血清及肾脏组织中的SOD活性(P<0.05)。结果如图1所示，表明血人参及制剂能提高衰老小鼠血清及各脏器组织中的SOD活性。

图1 血人参及制剂对衰老小鼠血清及各脏器组织中SOD活性的影响Fig.1 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the SOD activity in serum and organs of the aging mice

2.5 对小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性的影响

与正常组比较，模型组衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性极显著降低(P<0.01)。与模型组比较，除肝脏组织中、低剂量组外，血人参乙酸乙酯部位与芪胶升白胶囊各剂量组均能极显著提高衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性(P<0.01)。与阳性药VitE组比较，血人参乙酸乙酯部位除了肝脏组织低剂量组，各剂量组均能极显著提高衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性(P<0.01)，其中高、低剂量组能显著提高脑组织中GSH-Px活性(P<0.05)，低剂量组能显著提高心脏组织中GSH-Px活性(P<0.05)；芪胶升白胶囊除肝脏组织低剂量组外，其余各剂量组均能显著提高衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性(P<0.05)，其中高、中剂量组极显著提高脑组织与心脏组织中GSH-Px活性(P<0.01)，高、中、低剂量组极显著提高血清与肾脏组织GSH-Px活性(P<0.01)。结果如图2所示，表明血人参及制剂能提高衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性。

图2 血人参及制剂对衰老小鼠血清及各脏器组织中GSH-Px活性的影响Fig.2 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the GSH-Px activity in serum and organs of the aging mice

2.6 对小鼠血清及各脏器组织中MDA含量的影响

与正常组比较，模型组衰老小鼠心脏与肝脏组织中MDA含量极显著升高(P<0.01)，血清与肝脏组织中MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，血人参乙酸乙酯部位与芪胶升白胶囊高、中、低剂量组均能极显著降低心脏组织中MDA含量(P<0.01)，高、中剂量组极显著降低肾脏组织中MDA含量(P<0.01)；芪胶升白胶囊高剂量组显著降低肝脏组织中MDA含量(P<0.05)。与阳性药VitE组比较，血人参乙酸乙酯部位与芪胶升白胶囊高、中、低剂量组对血清与脑组织中MDA含量均无显著影响(P>0.05)，而高、中剂量组均能极显著降低肾脏组织MDA含量(P<0.01)；血人参高、中、低剂量组能极显著降低心脏组织MDA含量(P<0.01)，且高剂量组能极显著降低肝脏组织MDA含量(P<0.01)；芪胶升白胶囊高、中剂量组能极显著降低肝脏组织MDA含量(P<0.01)，高剂量组能极显著降低肝脏组织MDA含量(P<0.01)，中、低剂量组分别能显著降低肝脏与心脏组织中MDA含量(P<0.05)。结果如图3所示，表明血人参及制剂能降低衰老小鼠肝脏、肾脏与心脏组织中MDA含量。

图3 血人参及制剂对衰老小鼠血清及各脏器组织中MDA含量的影响Fig.3 Effect of Indigofera staclrvoides extract and its preparationon the MDA content in serum and organs of the aging mice

3 讨论

本实验采用KM小鼠为实验对象，以D-半乳糖皮下注射联合亚硝酸钠腹腔注射制备衰老模型。研究表明[12-15]，腹腔注射亚硝酸钠进入体内后使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，失去携带氧的能力，引起组织器官缺氧受损、大脑记忆与行为障碍；皮下注射D-半乳糖后，在体内其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢，在细胞内堆积致细胞肿胀与代谢紊乱，活性氧水平升高，机体产生过量自由基致神经元损伤及抗氧化酶活性降低导致衰老。在机体中SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，具有清除自由基从而达到保护细胞的作用[16-17]，MDA是由自由基诱导脂质过氧化作用生成的毒性产物，可反映机体被自由基攻击的损伤程度[18]。因此本研究采用D-半乳糖皮下注射联合亚硝酸钠腹腔注射制备记忆力低下、行为障碍、组织与器官功能性退化及抗氧化能力降低的小鼠衰老模型，与人整体衰老相似；以小鼠体重、脏器指数、小鼠学习记忆能力、SOD活性、GSH-Px活性与MD含量为检测指标，从抗氧化方面研究血人参提取物与芪胶升白胶囊的抗衰老作用。

模型组小鼠体重在造模后均低于其他组，表明D-半乳糖和亚硝酸钠联合注射可抑制小鼠体重正常生长，血人参乙酸乙酯部位与芪胶升白胶囊可改善衰老小鼠体质量。大量的D-半乳糖可使小鼠胸腺萎缩[19]，本实验中模型组和芪胶升白胶囊低剂量组胸腺指数低于正常组，其余各组的各脏器指数均无显著性差异，表明芪胶升白胶囊对小鼠各脏器指数无明显影响。通过水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，结果显示血人参乙酸乙酯部位与芪胶升白胶囊可增强衰老的小鼠的学习记忆能力。根据血清、脑及各脏器中SOD、MDA、GSH-Px检测结果显示，芪胶升白胶囊和血人参乙酸乙酯部位高、中剂量组均能增高血清、脑、心、肝、肾中SOD及GSH-Px的活性，高于模型组与阳性药物组；血人参乙酸乙酯部位及芪胶升白胶囊各剂量组血清和各脏器中MDA含量低于模型组，其中高、中剂量组低于阳性药物组。

血人参乙酸乙酯部位及芪胶升白胶囊具有较强的抗氧化活性，可增加抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化物的形成，降低各组织中MDA含量，延缓机体衰老。本实验利用D-半乳糖联合亚硝酸钠致小鼠衰老模型，并用血人参乙酸乙酯部位及芪胶升白胶囊进行干预，证明了其能抑制小鼠衰老，有利于进一步研究临床药效作用及抗衰老作用机制。