靶向肝癌肿瘤相关巨噬细胞的基础和临床的治疗手段

周金虹，张嘉欣，郭玉呈，郑 芳

（西安交通大学医学部基础医学院，西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061）

肝细胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)的病变通常发生在原发性肝硬化患者中，其特征是慢性炎症引发的环境失调，中后期则引发癌症。肝脏慢性炎症会引发持续性的全身性炎症以及免疫细胞刺激，因此诱导产生了大量巨噬细胞，导致肝硬化相关免疫功能障碍[1]。

肝脏巨噬细胞在慢性肝炎中诱发肝细胞损伤，而且激活肝星状细胞并使其纤维化，在肝癌免疫微环境中形成肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs），对肿瘤和其他基质细胞信号做出反应，导致HCC 的发生发展[2-3]。TAMs 通过提供细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等促进肿瘤的生长、血管生成、肿瘤细胞增殖及抑制癌细胞凋亡并诱发肿瘤转移[4]。肿瘤免疫逃逸与TAMs 密切相关，因为TAMs 通常呈现抗原呈递和协同刺激能力降低的特征，而且通过分泌抗炎细胞因子和诱导T 细胞功能耗竭，阻断免疫系统的识别和攻击，最终增强癌细胞逃逸机体免疫的能力。比如HCC 浸润的单核细胞通过表达高水平程序性死亡受体-配体1（programmed death ligand, PD-L1），与 CD8+T 细胞上的程序性死亡受体1（programmed death-1, PD-1）结合，从而抑制细胞毒性T 淋巴细胞活性，因此使用特异性抗体中和PD-1 或者PD-L1 分子，可以起到激活CD8+T 细胞的作用，重新激活脾脏免疫细胞，从而产生大量IFN-γ 细胞因子抑制癌症的发展[5]。肝癌免疫微环境是由周围环境决定的，大多数肿瘤的微环境还存在其他免疫细胞及其介质[6]，比如在肿瘤微环境中骨髓源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSC）和 调 节 性 T 细 胞（regulatory cells,Tregs）的相互作用下，抑制细胞毒性T 细胞的活性，MDSC 和Tregs还会进一步导致树突状细胞（dendritic cells, DC）的功能失调；另外，循环细胞和组织驻留Tregs 具有多种免疫和代谢传感器，容易受到肿瘤微环境的影响[7]。

TAMs 是实体瘤中最具代表性的白细胞群体，在局部肿瘤微环境影响下表现出表型异质性和多种功能[8]。因此，TAMs 在不同的微环境下有可能发挥截然相反的作用，有些具有抗肿瘤活性，而另一些则阻碍肿瘤的治疗效果。TAMs 的PD-1 表达越高，对肿瘤细胞的吞噬能力越低，因此TAMs 是检查点抑制剂免疫疗法的常用细胞靶点。在晚期肝癌或早期不适合局部区域治疗的患者可选择治疗方法有限的情况下，开发免疫检查点抑制剂是当下行之有效的选择之一。目前针对使用TAMs的靶向抑制剂在肝癌患者中的治疗方案已经进入了临床试验阶段。基于Ⅰ/Ⅱ期CheckMate-040 试 验中 的 研 究数 据 ，anti-PD-1 的免疫治疗已获得美国食品药品管理局（FDA）二线治疗批准[9]。在这项研究中虽然只有20%的患者对anti-PD-1 有阳性反应，但使用联合策略可以增强疗效并抵消免疫适应性反应中TAM 依赖性的器官损伤[10]。此外，临床前和早期临床资料均证明巨噬细胞可作为癌症和慢性炎性疾病的创新诊断和治疗策略的有效靶细胞之一[11]。

虽然靶向TAMs 的抑癌疗法在临床上的应用效果还有待进一步验证，但许多实体肿瘤的基础研究已表明其对肿瘤具有良好的治疗效果[12]。因此，本文首先就TAM 亚型的异质性和起源、其在HCC 中的发生发展过程中的动态表型和功能等内容进行探讨，随后总结肝细胞癌治疗的基础性研究进展和一些疗法向临床推进的限制因素，最后详细阐述组合疗法与临床使用疗法如索拉非尼和免疫检查点抑制剂等对HCC 治疗的贡献。

1 HCC 中 TAMs 的 概 念 和 来 源

肝巨噬细胞是由个体分化的Kupffer cells(KCs）和单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophage, Mo-Mf）组成[13]。KCs 是一种可以自我更新的非迁移性吞噬细胞，作为肝脏中抵抗肿瘤细胞的第一道防线[14]。在胚胎发育过程中，KCs 起源于卵黄囊衍生的特异性祖细胞。在肿瘤微环境中，恶性和基质细胞分泌的趋化因子募集骨髓来源的Ly-6chi单核细胞，这些浸润的单核细胞发展为大量的Mo-Mf；浸润后，Mo-Mf 似乎获得了增殖能力；Mo-Mf 进一步分化，在特定环境下可以取代并获得几乎无法与常驻KCs 区分的相似表型，最终发育为Mo-KC（monocyte-derived Kupffer cell）（图 1）[15]。然而，尚不清楚肝脏是否能够不依赖募集反应而维持肿瘤病变中的TAMs 数量。由于肝脏中巨噬细胞的持续性转变，肝髓细胞间室动态变化，由处于不同分化状态的巨噬细胞亚型组成，每一种状态都与细胞表面标志物表达的改变相关，因此表面标志物的表达可用于鉴定巨噬细胞的亚型。在许多研究中，CD68 是常用的组织巨噬细胞标志物，但该标记物的特异性并不高。本团队之前的研究发现两种新的标志物用于区分Mo-Mf 和KCs：Clec4F 和 Tim4。 Clec4F 和 Tim4 在 KCs 表 面均有表达，但浸润的Mo-Mf 不表达这两种标志物。在肝脏巨噬细胞动态分化的过程中，发现Mo-KCs 在分化后的第1 周内不表达Tim4，随着时间的推移，Mo-KC 也将表达Tim4。因此，基于这个现象可以通过 Clec4F 和 Tim4 的表达来区分 Mo-Mf、Mo-KC 和KCs[16]。

图1 肝脏肿瘤微环境中TAMs 的起源及其靶向策略Fig.1 Origin and targeting strategies of TAMs in the liver tumor micro-environment

目前尚不清楚TAMs 是源于组织驻留的肝巨噬细胞，还是来自骨髓浸润Mo-Mf 进一步分化而来。在大多数报道中，肿瘤微环境中的巨噬细胞被认为是“肿瘤相关的巨噬细胞”。最初认为KCs 只参与抗肿瘤免疫，却也有大量证据表明KCs 是TAMs 亚群的一部分，有促进肿瘤生长的作用[17]。肝脏通过门静脉从肠道供血，同时通过肝动脉从血液循环供血，因此位于肝窦中的KCs 暴露于血液中的细菌和相关毒素中。肠道微生物菌群组成的改变和/或肠道通透性的增加都可以通过受损肝细胞释放的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）和病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）激活 KCs。DAMPs 结合特定的受体激活炎症，并招募中性粒细胞和单核细胞启动有效的组织修复。DAMPs 和PAMPs 与KCs 上的模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）相互作用或直接激活炎性体，例如，脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）与 KCs 表面的 TLR-4 相互作用，在小鼠模型中刺激产生促癌信号通路[18]。

炎性小体是一种多蛋白细胞质复合物，属于先天免疫系统，如NLRP3 在KCs、肝星状细胞和肝细胞中表达，是肝脏炎症中最常见复合物之一。PAMPs 通常会引发初始的级联反应，引起先天和细胞介导的免疫反应。促炎细胞因子、激活的补体和其他介质的上调，加上PAMPs 对细胞的直接损伤所引起的炎症可释放DAMPs。PAMPs 和DAMPs 直接或通过宿主PRR（如toll 样受体）被识别，导致炎性小体的组合和活化以及 IL-1β 和 IL-18 的释放，IL-1β 和 IL-18 是有效的炎性细胞因子。炎性小体过度活跃导致小鼠的细胞死亡（特定形式的细胞死亡），加快肝脏炎症和纤维化发展。然而，炎症小体激活在HCC 中的促进或抗肿瘤作用尚未完全阐明。木犀草营是一种天然存在的黄酮类化合物，通过抑制HCC 细胞中的NOD 样受 体 家 族 pyrin 域 3（NOD like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3）表达来抑制肿瘤的增殖和转移。研究表明，人HCC 中NLRP3 炎性小体的缺失会促进肿瘤生长，同时证实缺乏的炎性小体表达与HCC 晚期生长状况呈正相关[19]。在最近的一项研究中，17β-雌二醇治疗通过上调诱导癌细胞细胞凋亡的NLRP3 炎性小体可以显著抑制HCC 细胞的恶性转化[20]。

2 HCC 中 TAMs 的 表 型 和 功 能

如果仅将TAMs 定义为一个群体，是有局限性的，如表1 所示，TAMs 与HCC 的预后研究的结果常常自相矛盾。这主要是由于TAMs 的定义过于一般化，如果要深入研究TAMs 与HCC 的关系则需要根据它们的极化程度进一步细分，作为不同的亚群进行研究分析。因为巨噬细胞可以根据来自肝脏微环境的信号迅速适应其表型，那么巨噬细胞的极化是巨噬细胞通过何种信号被激活？比如，M1 巨噬细胞是由Th1 细胞或微生物产物产生的炎性细胞因子激活，在宿主防御感染中起关键作用。巨噬细胞的M2 表型在白细胞介素IL-4、IL-13 和IL-10 分泌时被激活，主要表现出抑制免疫调节活性。然而，这种传统命名法来源于体外研究，并不能完全复制慢性炎症或复杂的肿瘤微环境。因此，巨噬细胞亚群在癌变过程中的表达和分泌谱不是绝对的，有可能同时包含M1/M2 谱两个谱系的特征[21]。小鼠和人类细胞在巨噬细胞极化的相关分子表达也有较大的差异，如氨基酸代谢酶就有很大的不同。在实验方法操作方面，由于小鼠研究中常用的骨髓或组织作为髓系细胞的实验样品来源，而人的巨噬细胞通常是从血液单核细胞中分离出来的，因此许多小鼠巨噬细胞常用的标记物与人的巨噬细胞标志物是不一致的。

表1 肝细胞癌的TAMs 鉴别及极化预后Tab. 1 TAMs identification and polarization prognosis of hepatocellular carcinom

巨噬细胞促炎和抗炎模式的定义也会引出一个令人困惑的假设。在炎症相关肿瘤中，M2 表型按道理应该是有益的，但是在实际情况中，在HCC 的肿瘤进展过程中，巨噬细胞的功能从M1 型极化为M2 型，这种M2 型巨噬细胞的抗炎表型不仅不会使炎症消退，而恰恰因为这些巨噬细胞处于免疫缺陷和免疫抑制状态，从而进一步导致癌细胞的免疫逃避。同时，TAMs 的促炎表型也不是指急性环境中的炎症损伤，而是指对肿瘤细胞协同免疫攻击能力。因此，不能用M1/M2 型简单地描述癌症中肝巨噬细胞的极化，这种表述过于简单[22]。因为TAMs 经常同时表达M1/M2 型的标记物，如果要在研究中区分这两种表型，需要充分考虑到其对应表面标记物的表达比例。此外，巨噬细胞的极化不仅取决于疾病的分期，而且在肿瘤结节之间或同一肿瘤的不同部位也存在差异。例如，在人类HCC 中，大多数位于血管周围的TAMs更像M1 型，而在缺氧区的TAMs 更像M2 型。

研究TAMs 常用免疫组织化学染色的方法，经常用于 CD68 和 CD86（M1）或 CD163 和 CD206（M2）量化和分类TAMs[23]。此外，还可以利用ELISA 检测血清sCD163 水平。

3 HCC 中靶向 TAMs 的治疗方法

目前靶向TAMs 的治疗方法旨在通过清除肿瘤中存在的TAMs 来阻断骨髓来源的单核细胞的募集达到减少TAMs 数量的目的，或对TAMs 重新编程后改变其极性使TAMs 具有抗肿瘤的作用。

3.1 基础研究

本节重点讨论和总结表2 中直接作用于靶向TAMs 药物的荷瘤小鼠模型相关基础研究，基因治疗或基因敲除模型本综述不做讨论。

表2 通过使用清除TAMs 的方法建立HCC 模型治疗的基础研究Tab. 2 Per-clinical research on HCC tumor models treatment by using TAMs depletion methods

3.1.1 TAMs 耗竭疗法 脂质体是一种人工制备的囊泡，注射后被巨噬细胞吞噬，用其装载氯磷酸盐（一种用于治疗骨质疏松症的双膦酸盐），该药物可诱导细胞内被吞噬的脂质体中内容物释放，最终诱导巨噬细胞凋亡。实验证明，用氯膦酸脂质体耗竭TAMs后，HCC 移植小鼠的HCC 生长抑制减弱。氯丙酸酯(Cl2MDP)包被的脂质体可以部分耗竭TAMs(免疫组化染色为F4/80 和CD68 阳性细胞)，导致Hepa1-6细胞诱导的荷瘤小鼠模型的肿瘤生长减缓。Genipin可以抑制TAMs 的迁移，降低TAMs 来源的炎性细胞因子表达，结果表明，脂质体治疗的小鼠模型的肿瘤中M2 型TAMs 的数量明显低于未治疗小鼠模型的肿瘤中TAMs 的数量。相比之下，对M1 型TAMs的数量变化没有明显的影响[40]。

TAMs 靶向治疗设计的难点是仅选择性清除促肿瘤的巨噬细胞，而不是清除所有具有吞噬能力的巨噬细胞。因为当肿瘤合并感染发生时，如果药物会导致普通巨噬细胞过度减少，则有可能导致严重的副作用。因此，巨噬细胞亚群特异性表面标记物的使用就是解决这一问题的最好方案，特异性标记物分子已在分子成像领域成功使用[41]。使用纳米抗体偶联SPECT 或PET 核素后制备的放射性示踪剂，可以特异性靶向TAMs，并实现KC 特异性和M2 型TAMs的特异性成像，在肿瘤微环境中识别M2 型巨噬细胞，作为癌症进展和预后的指标[42]。此外，这种方法将来也有在临床上评估药物治疗效果的巨大潜力。但是，还应该注意TAMs 与肿瘤微环境中的其他免疫细胞和基质细胞有着密切的联系，尚不清楚其他细胞在消耗后会在多大程度上补偿TAMs 的功能。

3.1.2 抑制单核细胞的募集疗法 HCC 是一种致死性疾病，常发于肝脏慢性炎症。C-C motif 趋化因 子配体 2（CCL2/MCP1）是一种募集 CCR2（C-C chemokine receptor type 2, CCR2）免疫细胞并促进炎症的趋化因子，在肝细胞癌患者中高度上调，以此可以作为抑制单核细胞募集的重要靶分子[43]。用CCR2 拮抗剂作为药物可以抑制不同小鼠模型中HCC 的生长，该疗法显著减少了血液中Ly6Chigh炎症单核细胞的数量，从而降低了HCC 中TAMs（CD11b和F4/80 阳性细胞）的数量，同时减少了M2 型TAMs（CD206 阳性细胞）产生的大部分细胞因子和趋化因子[44]，结果还发现剩余的TAMs 逐渐向M1 表型转变。CCR2 拮抗剂还通过阻断TAMs 介导的免疫抑制来重新激活肿瘤浸润的CD8+T 细胞抗癌活性。通过减少HCC 小鼠模型中炎性髓细胞的数量，TENG 等人进一步证明了CCL2 中和抗体的抑瘤治疗作用[23]。虽然有几种趋化因子均参与募集单核细胞并且靶向一个通路，但是其他趋化因子不能完全消除单核细胞的募集，阻断CCL2-CCR2 似乎是现阶段有效抑制HCC 的方法。

骨髓浸润的单核细胞被认为是肿瘤微环境中TAMs 最重要的来源，但是目前尚不清楚TAMs 是否能够通过招募巨噬细胞维持其在肿瘤中的数量，也不清楚TAMs 在肿瘤微环境中的细胞寿命。因为在早期阶段TAMs 也具有抗肿瘤功能，所以抑制单核细胞募集的有效时间和用药时间点还存在一定争议。

3.1.3 TAMs 极化的重新编程疗法 黄芩苷是一种存在于多种药用植物中的天然类黄酮，通过启动TAMs 重编程后使之极化为有促炎细胞因子产生的M1 型巨噬细胞，从而抑制原位小鼠模型中HCC 的发展。实验证明，HCC 细胞与黄芩苷处理的巨噬细胞共培养可降低其体外增殖和迁移的能力。集落刺激因子-1（colony-stimulating factor-1, CSF-1）及其受体（colony-stimulating factor-1 receptor, CSF-1R）也可以调控巨噬细胞的分化和功能，因此使用竞争性抑制剂阻断CSF-1R 可显著延缓小鼠异种移植瘤的生长。该化合物在体外表现出抑制巨噬细胞增殖的能力，但对体内浸润的巨噬细胞无抑制作用，基因表达谱显示经治疗的肿瘤中TAMs向M1 表型极化[45-46]。

在理论上，M1 型巨噬细胞的失衡也可能诱导产生细胞毒性和炎性环境改变而使得其有反作用，但所幸在上述研究中，并未观察到毒副作用，但这种重编程疗法的效果和弊端仍需进一步探讨。

3.1.4 阻断下游TAMs 产物效应的疗法 在HCC研究进展过程中，TAMs 是分泌IL-6 的主要来源，而IL-6 在HCC 起始阶段发挥了重要作用。实验证明使用经FDA 批准的抗IL-6 受体抗体Tocilizumab 阻断IL-6 信号转导，可在体内外抑制TAMs 刺激的癌症干细胞活性[47]。

3.2 靶向TAMs 疗法的基础研究和目前已使用的针对TAMs 的临床治疗

HCC 是肝病患者最常见的肝癌，死亡率高。晚期HCC 患者的首选药物是一种抗血管生成的口服多激酶抑制剂索拉非尼，也是目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）和欧洲药品管理局（European Medicines Agency,EMA）批准的用于晚期HCC 患者的标准一线系统治疗药物。然而，在接受长期索拉非尼治疗的HCC 患者中观察到该药物的适应性耐药，因而降低了其药效。因此，克服索拉非尼的耐药性是改善HCC 晚期治疗的重要途径之一。研究表明，在HCC 模型细胞系HepG2 中筛选到了索拉非尼耐药的候选生物标志物[48]。在HCC 模型中，索拉非尼的施用降低了M2 型的TAMs，抑制其免疫抑制作用，并刺激抗肿瘤自然杀伤细胞（Natural Killer Cell,NK）的反应。此外，SPRINZL 等[49]证实在索拉非尼治疗期间，21 例HCC 患者CD163 的血清浓度降低。因为可溶性sCD163 被活化的巨噬细胞分泌到血清中，可以作为跟踪M2 型巨噬细胞反应的指标，CD163 在血清浓度降低这一现象证明索拉非尼在HCC 患者中可以抑制M2 型巨噬细胞的活化[50]。综上所述，调节巨噬细胞的极性与索拉非尼的抗癌有效性密切相关。

索拉非尼与氯膦酸脂质体或者唑来膦酸(另一种用于治疗骨转移的双膦酸盐)等TAMs 靶向药物的联合应用增强了索拉非尼对HCC 异种移植小鼠模型肿瘤血管生成、生长和侵袭的抑制作用。血管生成是癌症的特征之一，为癌变组织提供营养物质以促进其快速生长，因此靶向肿瘤相关血管生成是癌症治疗的一个重要目标，目前有许多药物用于抑制肿瘤相关的血管生成。索拉非尼联合唑来膦酸治疗晚期HCC 的二期研究(NCT01259193)尚未见报道[51]。除巨噬细胞耗竭外，通过双膦酸盐包裹的脂质体，含氮双膦酸盐（如唑来膦酸）可激活γδT 细胞，增强其抗肿瘤功能[52]。索拉非尼联合CCR2 拮抗剂抑制单核细胞浸润的增强疗效已在小鼠HCC 模型中得到证实[53]。这种效应不仅体现在索拉非尼这种药物上，在大鼠异种移植肿瘤模型中，通过动脉化疗栓塞、唑来膦酸等局部疗法联合抑制TAMs浸润(F4/80+)并抑制肿瘤血管生成，最终疗效显著。虽然经TACE 在HCC 治疗中被证明有效，但它并不是一种公认的治疗方法。

PD-1是一种免疫检查点受体，在激活的T 细胞中上调，诱导产生免疫耐受。肿瘤细胞常高表达PD-L1，促进其免疫逃逸。TAMs 表达PD-L1 并参与了免疫抑制肿瘤微环境的形成，检查点阻断免疫治疗对TAMs 的影响已在其他实体肿瘤中得到证实，但在HCC 中尚无相关实验数据。近年来，通过阻断免疫检查点进行免疫治疗促进了癌症治疗的发展。PD-L1是PD-1 的配体表达于癌细胞、树突状细胞和巨噬细胞的表面，癌细胞上的PD-L1 与T 细胞上表达的PD-1 的结合导致T 细胞衰竭，并阻止进一步的免疫排斥反应，从而导致免疫逃逸。据报道，在对HCC 患者的研究中观察到PD-L1 在瘤内表达的升高，这与HCC 的预后不良有关。PD-1 在体内阻断TAMs 的极化，降低了结直肠癌小鼠模型中肿瘤生长，延长了小鼠的生存期。细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4（Cytotoxic T lymphocyte associated antigen,CTLA-4）单克隆抗体在黑素瘤小鼠模型和人体内的作用是通过抗体依赖性细胞毒性靶向TAMs。同样在胰腺癌小鼠模型中，通过阻断CSF-1/CSF-1R 和免疫疗法（PD-1 和 CTLA-4 拮抗剂）减少 M2 型的 TAMs 和再极化，从而延缓了肿瘤的发展。

4 展 望

肿瘤发生发展过程中的初始损伤识别的级联反应、单核细胞募集引起的炎症扩增，以及肝脏中功能不同的巨噬细胞分化为不同的巨噬细胞群，都为HCC 的治疗干预提供了不同的途径。目前研究证实，TAMs 参与了肿瘤炎症、肿瘤转移、血管生成、免疫逃避、化学耐药等过程。尽管TAMs 靶向治疗的临床应用尚处于起步阶段，但大量HCC 荷瘤小鼠模型的基础研究已显示出良好的治疗结果。如何清除促肿瘤生长的TAMs 而不会影响(甚至增强)抗肿瘤免疫的巨噬细胞是现今要克服的关键问题，新的疗法需要更好地提高靶向TAMs 亚型的特异性；另外，如何促进TAMs 极化为无毒副作用的抗肿瘤细胞，而且如何精准调控TAMs 的两极分化，从而达到更完美平衡也是现阶段的研究热点。在实体肿瘤中观察到免疫检查点抑制剂具有良好HCC 治疗作用，目前索拉非尼等肝癌临床治疗的应用结果令人鼓舞，其治疗机制研究将是下一步探索的主要方向。