Cathepsin D在不同宫颈病变中的表达意义及其与高危型HPV感染的相关性

欧阳晨捷 周东华 刘小燕 陈莹 平静 葛娟 潘育

目前宫颈癌是严重威胁女性生命健康的第二大疾病，其中以宫颈鳞状细胞癌为最常见的组织学类型。我国每年新增宫颈癌人数约9.89 万，占世界宫颈癌总人数的17.4%，每年死亡的人数达到3.05万，有发病率不断上升及发病年龄日趋年轻化的迹象[1]。因此，提高宫颈癌的诊治水平十分紧迫。人乳头瘤病毒（HPV）已被证实是宫颈癌的首要致病因素[2]，从感染到进展为癌需要8～10年。对宫颈上皮内病变（CIN）的患者早诊断、早治疗以及系统随访是降低宫颈癌发病的关键。但不是所有感染高危型HPV的女性都会发生CIN或宫颈癌，说明在宫颈癌发生发展中，还有除了病毒以外的因素发挥致病作用。近年来，研究发现Cathepsin D参与了多种肿瘤的发生与发展[3，4]，是一类肿瘤侵袭、转移相关的酶。但是，Cathepsin D在宫颈鳞癌中的表达情况鲜有报道。本研究旨在探讨Cathepsin D在不同宫颈病变中的表达情况，分析其与高危型HPV感染的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集我院病理科2018年1月～2020年8月期间确诊的40例子宫颈鳞状细胞癌手术切除的患者组织标本（宫颈癌组）和58例CIN经阴道镜活检、宫颈锥切及子宫全切术标本（CIN组）；同时选取同期因子宫肌瘤和（或）子宫腺肌症行子宫全切术的住院患者，术前常规行宫颈液基细胞学检查，未见异常，并通过病理证实为慢性宫颈炎（等同于本实验的正常宫颈组织）标本28例（对照组）。其中CINⅠ21例，CINⅡ18例，CINⅢ19例。患者年龄28～65岁，中位年龄45岁。所有患者在取材前都未做过任何特殊治疗，也无特殊疾病史。

鼠抗人单克隆抗体Cathepsin D（D-7）:sc-377299购自美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC。免疫组织化学Power Vision二步法试剂盒（PV-9 000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二抗DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Cobas 4800 HPV DNA检测系统购自罗氏诊断公司。

1.2 免疫组织化学染色方法 组织切片经常规脱蜡、脱水后，用0.01mol/L的枸橼酸缓冲液高压修复10min,冷却到室温后，PBS冲洗3次，每次3min；3% H2O2室温孵育10min，PBS冲 洗3次，每 次5min；滴加稀释浓度为1：50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫组织化学试剂盒（PV-9000）的说明书进行操作，二抗孵育30min后，DAB显色剂显色，苏木素复染，返蓝，脱水，透明，中性树脂封片，显微镜下观察。以Cathepsin D抗体试剂盒说明的涎腺组织作为阳性对照标本，同时采用PBS液取代一抗作为阴性对照标本。

1.3 高危型 HPV 检测 基于实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术的Cobas 4800 HPV DNA检测系统可检测14种HPV高危亚型，即HPV16型、18型和其他12种高危HPV亚型汇总的结果。

1.4 结果判定 Cathepsin D阳性表达主要为细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒，但要考虑到着色的强度及阳性细胞所占比例。本实验建立了一个分值累加的系统：①按着色强度打分：无着色0分，淡黄色颗粒1分，棕黄色颗粒2分，棕褐色颗粒3分；②在目镜视场数为22的200倍显微镜下，随机看5个视野，取平均值，按阳性细胞所占比例打分：＜1%计为0分，1%～10%计为1分，10%＜阳性细胞数≤50%计为2分，50%＜阳性细胞数≤80%计为3分，＞80%计为4分。将①、②两项分值相加为免疫组化最终评分，阴性：0～1分，阳性：2～7分。全部实验对象的免疫组织化学染色切片由两位病理医师一致性双盲观察诊断。

1.5 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。组间率的比较采用χ2检验。两组变量间的相关分析采用Spearman等级相关分析。检验采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cathepsin D在对照组、CIN 组和宫颈癌组中的表达 Cathepsin D在各组宫颈组织中的表达水平不同，在对照组、CIN 组、宫颈癌组中的阳性表达率分别为14.3%（4/28）、79.3%（46/58）、95.0%（38/40），各组间差异有统计学意义（χ2=55.518，P＜0.01）。宫颈病变逐渐加重，随着Cathepsin D的阳性表达率逐渐升高，与宫颈病变程度呈正相关（r=0.608，P＜0.01）。见图1～5。

图1 Cathepsin D在正常子宫颈组织中的表达

图2 Cathepsin D在CINⅠ中的表达

图3 Cathepsin D在CINⅡ中的表达

图4 Cathepsin D在CINⅢ中的表达

图5 Cathepsin D在宫颈鳞癌中的表达

2.2 Cathepsin D在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ组 内的表达在CIN组内，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中Cathepsin D的阳性表达率分别为61.9%（13/21）、83.3%（15/18）、94.7%（18/19），差异有统计学意义（χ2=6.810，P＜0.05）。

2.3 Cathepsin D在正常对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组各组之间的比较 CIN组Cathepsin D阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（χ2= 32.807，P＜0.01），宫颈癌组Cathepsin D阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（χ2= 45.437，P＜0.05），宫颈癌组Cathepsin D阳性表达率高于CIN组，差异有统计学意义（χ2= 4.759，P＜0.05）。CINⅠ组和CINⅡ组（χ2= 2.198，P＞0.05）、CINⅡ组和CINⅢ组（χ2= 1.247，P＞0.05）以及CINⅢ组和宫颈癌组（χ2= 0.002，P＞0.05）之间差异无统计学意义，而在CINⅠ组和CINⅢ组之间差异有统计学意义（χ2= 6.166，P＜0.05）。

2.4 Cathepsin D和高危型HPV在宫颈病变组织中的相关性分析 通过Spearman等级相关分析提示，在不同程度宫颈病变中，Cathepsin D的表达与高危型HPV的感染呈正相关（P＜0.05）。见表1。

表1 Cathepsin D和高危型HPV的相关性分析（n）

3 讨论

宫颈鳞癌的发病是一个从组织非典型增生到原位癌再到浸润癌循序渐进的过程。发现高危型HPV病毒与宫颈癌发生有直接关系。在细胞恶性转化过程中，E6、E7基因过度表达让病毒基因整合，使宿主细胞的肿瘤抑制蛋白P53、Rb失活[5]。无疑持续的高危型HPV感染是导致CIN及宫颈癌的首要因素。但感染高危型HPV并不完全造成必然发生宫颈癌，还需要其他方法的适当介入来提高宫颈癌筛查的准确率。近年来，研究者们发现Cathepsins（组织蛋白酶）作为人体中重要的信号分子，有序地调节着人体的生命过程；一旦失调，会导致肿瘤的发生。根据氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11个成员，分布于各种哺乳动物组织的细胞溶酶体内，是一组强效的溶酶体水解酶，与肿瘤侵袭、转移相关[6]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一员，是一种天冬氨酸溶酶体蛋白水解酶。在肿瘤的酸性微环境中，Cathepsin D的高表达可作为一种丝裂原会引起有丝分裂时，有丝分裂原底物的调控失常，引起细胞分化的缺乏，并且刺激细胞不断迅速分裂、生长，引起克隆性无限增殖[7]。本研究发现Cathepsin D在CIN和宫颈癌组织中的阳性表达率均高于正常宫颈组织（P＜0.05），在宫颈癌组织的阳性表达率高于CIN组织（P＜0.05），在CINⅢ组织的阳性表达率高于CINⅠ组织（P＜0.05），Cathepsin D的阳性表达率与宫颈病变程度呈正相关（r=0.608，P＜0.05），符合宫颈鳞癌的进展过程，可提示Cathepsin D的表达上调促进了宫颈鳞癌的发生与发展。Cathepsin D一方面通过水解作用使细胞外基质降解，让肿瘤细胞顺利快速转移；另一方面通过使Cathepsin B、尿激酶原激活因子激活，并与尿激酶原激活因子受体结合，参与与肿瘤相关的分解作用[8]。Cathepsin D的过度表达还可激活溶酶体靶通道，让Cathepsin D蛋白酶原及其它溶酶体酶不断分泌和释放[9]，促进了周围局部溶解区域的形成，为肿瘤细胞的侵袭转移提供了通道，进而激发了肿瘤细胞侵袭转移的潜能。通过Spearman等级相关分析，在不同程度宫颈病变中，Cathepsin D的表达与高危型HPV的感染呈正相关（r=0.242，P=0.006），提示Cathepsin D表达上调和高危型HPV感染在宫颈癌的发病机制中可能起着协同作用。

综上所述，Cathepsin D在子宫颈鳞状细胞癌发生发展过程中表达逐渐升高，说明Cathepsin D在宫颈癌的发病机制中起到了一定的促进作用，可能参与宫颈鳞癌的侵袭转移过程。Cathepsin D的高表达和高危型HPV的感染在宫颈病变的发生发展过程中有着密切的联系，两者在宫颈癌的发病机制中可能起着协同作用，为宫颈癌发病机制和治疗的研究提供了新思路，但这一推测需要后续的实验研究进一步验证。