信号转导及转录激活因子3、垂体同源框 1及胶质瘤相关癌基因同源蛋白- 1在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义

马潇潇，郭春香，陈官芝

青岛大学附属医院皮肤科，山东 青岛 266000

皮肤恶性黑色素瘤为起源于外层胚叶神经嵴黑色素细胞的一类体表恶性肿瘤，其发病例数约占所有肿瘤的3%，居皮肤恶性肿瘤的第3位[1]。此外，研究显示，皮肤恶性黑色素瘤的发病主要与环境、遗传性基因变异等因素有关，其中最为主要的外源性致病原因是皮肤暴露于紫外线照射中[2]。因皮肤恶性黑色素瘤在发病初期易发生转移、侵袭，且治疗难度较大，患者预后差、病死率高，因此探寻皮肤恶性黑色素瘤发生、发展的相关机制，对改善患者预后具有重大意义[3]。信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、垂体同源框1（pituitary homeobox l，PITX1）及胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1（glioma-associated oncogene homoglog-1，Gli-1）在肿瘤组织中呈异常表达，并与多种肿瘤的发生、发展具有紧密关系。但目前关于STAT3、PITX1及Gli-l在皮肤恶性黑色素瘤中作用机制的研究较为少见。基于此，本研究就STAT3、PITX1及Gli-l在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义进行探讨分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年8月至2020年8月于青岛大学附属医院治疗的皮肤恶性黑色素瘤患者的病历资料。纳入标准：①经病理检查、CT检查等证实，均符合皮肤恶性黑色素瘤诊断标准；②未接受相关治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、器官衰竭等；②合并精神疾病；③存在其他皮肤疾病；④有免疫系统疾病或结缔组织病变。根据纳入、排除标准，共纳入89例皮肤恶性黑色素瘤患者，其中男50例，女39例；年龄37～68岁，平均（56.37±4.56）岁；TNM分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期17例。选取皮肤恶性黑色素瘤患者的肿瘤组织及癌旁组织（距肿瘤组织﹥3 cm）。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

所有组织于手术切除后立即使用10%甲醛固定，切片后脱蜡、水化。采用免疫组化法进行检测，将标本浸泡于3%过氧化氢中20 min，封闭其内源性过氧化物酶活性。高压枸橼酸盐抗原修复，温水清洗后使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次3 min，同时在其中滴加正常羊血清以阻断非特异性结合，放入37℃孵育箱30 min。滴加一抗兔抗人STAT3多克隆抗体（1∶200）、兔抗人PITX1多克隆抗体（1∶200）、兔抗人Gli-1多克隆抗体（1∶150），4℃过夜，PBS再次清洗，滴加生物素标记的STAT3、PITX1、Gli-1蛋白二抗，以37℃孵育0.5 h，于第3次PBS清洗后，滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，采用苏木素复染，于脱水、干燥后使用中性树脂封片，用PBS代替一抗作为阴性对照。

根据阳性细胞百分比及染色情况判定STAT3、PITX1、Gli-1的表达情况[4-6]。阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，﹥50%为3分。染色情况：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。总分为上述2项评分的乘积，≤3分为阴性表达，≥4分为阳性表达。

1.3 观察指标

对比肿瘤组织与癌旁组织中STAT3、PITX1、Gli-1表达情况。经回院复查、电话随访等方式了解皮肤恶性黑色素瘤患者的预后情况，随访1年，以发生复发或死亡作为预后不良的标准将其分为预后良好以及预后不良，比较预后良好及预后不良患者STAT3、PITX1、Gli-1蛋白表达情况，并对皮肤恶性黑色素瘤患者预后的影响因素进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；影响因素分析采用Logistic回归分析；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织与癌旁组织中STAT 3、PITX 1、Gli- 1表达情况的比较

肿瘤组织中STAT3、Gli-1蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织，PITX1阳性表达率明显低于癌旁组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 肿瘤组织与癌旁组织中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表达情况的比较[ n（%）]

2.2 预后良好与预后不良患者肿瘤组织中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表达情况的比较

所有患者均成功完成随访，其中预后良好61例，预后不良28例。预后不良患者肿瘤组织中STAT3、Gli-1蛋白阳性表达率均高于预后良好患者，PITX1阳性表达率低于预后良好患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表2）

表2 预后良好与预后不良患者肿瘤组织中STAT 3、PITX 1、Gli- 1蛋白表达情况的比较[ n（%）]

2.3 皮肤恶性黑色素瘤患者预后影响因素的单因素及多因素分析

Logistic回归分析显示，肿瘤直径≥5 cm、STAT3阳性、PITX1阴性、Gli-1阳性均为皮肤恶性黑色素瘤患者预后不良的独立危险因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 皮肤恶性黑色素瘤患者预后影响因素的单因素及多因素分析

3 讨论

黑色素瘤是由于黑色素细胞异常增生所形成的，属于恶性肿瘤，多发生于皮肤及黏膜组织，据不完全统计，90%左右的黑色素瘤为皮肤黑色素瘤[7-8]。随着近些年来检测水平的提升，对于皮肤恶性黑色素瘤的检出率也逐年提高，但由于皮肤恶性黑色素瘤发病较为隐匿，致使患者对其不够重视，从而导致多数患者在就诊时病情已发展至中晚阶段，严重影响治疗效果[9]。因此，对皮肤恶性黑色素瘤的致病机制进行深入了解，探寻皮肤恶性黑色素瘤的分子标志物，为临床治疗提供新思路，对改善患者的预后具有重要意义。

STAT3为信号转导与转录激活因子家族成员，在多种因子的细胞转导中起着重要作用。STAT3一般存在于细胞质中，在正常状态下，STAT3仅会被短暂激活，持续时间仅为几分钟或者几小时，而当机体出现肿瘤时，STAT3会处于持续激活的状态，且会移位到细胞核中，并对目的基因的表达进行恒定调控，并促进肿瘤细胞的增殖、转移[10]。目前较多研究已证实，STAT3在食管癌、胃癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中异常表达，但较少见STAT3在皮肤恶性黑色素瘤中的研究报道[11]。本研究结果显示，肿瘤组织中STAT3阳性表达率明显高于癌旁组织，且预后不良患者STAT3阳性表达率高于预后良好患者，提示STAT3可能在皮肤恶性黑色素瘤的发生、发展过程中起着重要作用。

PITXl属于PITX转录因子家族成员，其与黑素细胞皮质素原基因的表达存在一定的联系，并参与人体四肢的发育过程[12]。研究指出，PITX1为一种特殊的转录调节因子，其通过对细胞中端粒逆转录酶的转录激活发挥抑制作用，以影响细胞的增殖、分化，且PITXl还有着抑制致癌基因RAS转录活性的功能[13]。本研究中，肿瘤组织中的PITX1阳性表达率明显低于癌旁组织，且预后不良患者PITX1阳性表达率低于预后良好患者，这说明PITXl可能对皮肤恶性黑色素瘤的发生、发展起负性调控作用。Gli-l属于Gli蛋白家族成员，为刺猬因子通路下游的一种重要转录因子，已被证实在髓母细胞瘤、肝癌及胃癌中异常表达[14]。且研究表明，Gli-l蛋白不仅是刺猬因子通路下游的效应点，且可能为癌变的致病机制信号通路的交叉点，可与其他信号通路的分子共同参与肿瘤的发生、发展过程[15]。本研究中，肿瘤组织中Gli-1阳性表达率明显高于癌旁组织，且预后不良患者Gli-1阳性表达率高于预后良好患者，进一步证实了上述观点，说明可将Gli-l蛋白作为观察皮肤恶性黑色素瘤患者预后情况的指标。本研究对皮肤黑色素瘤患者预后影响因素进行分析，得出肿瘤直径≥5 cm、STAT3阳性、PITX1阴性、Gli-1阳性均为皮肤恶性黑色素瘤患者预后不良的独立危险因素。综上所述，STAT3、PITX1及Glil蛋白在皮肤恶性黑色素瘤中存在异常表达，通过检测其水平能为临床预后及治疗提供新的思路与依据。