PAX-1 甲基化应用于HPV 阳性患者宫颈癌筛查的价值研究

马媛 李颖 马海兰

宫颈癌是妇科的常见肿瘤,随着人们生活模式的转变,近年来宫颈癌的发病率呈逐年上升的趋势［1］。宫颈癌患者的死亡率较高,患者的死亡原因与肿瘤的转移存在着密切的联系,因此能够早期对宫颈癌患者进行诊断、转移的判断能够有效提高患者的预后［2,3］。1995 年,国际癌症研究机构(IARC)专题讨论会明确指出HPV 感染在宫颈癌的发生过程中起着十分重要的作用,但是关于其具体的致病机制仍然不明确［4］。已有较多研究证实编码基因异常甲基化在胃癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织均明显存在,同时与上述肿瘤的恶性生物学行为密切相关,PAX-1 是另一种重要的抑癌基因,有研究显示PAX-1 基因在宫颈癌患者中存在普遍的甲基化现象［5］。本研究通过分析HPV 阳性的宫颈癌患者的PAX-1 基因甲基化情况,旨在探索潜在的HPV 导致宫颈癌的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年6 月～2021 年6 月本院收治的120 例宫颈癌患者为研究对象,依据HPV 检查结果分为阳性组(HPV 阳性)与阴性组(HPV 阴性),各60 例。另选择同期收入本院的HPV 阳性而宫颈正常的患者60 例作为对照组。阳性组年龄43～83 岁,平均年龄(51.5±11.0)岁；阴性组年龄42～81 岁,平均年龄(52.0±11.5)岁；对照组年龄42～80 岁,平均年龄(53.0±11.2)岁。三组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本次研究均征得患者及其家属的同意,并经本院伦理委员会审批通过。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①宫颈癌患者经取材活检病理检查确诊为宫颈癌；②选取患者均为首次就诊,此前未进行过阴道抗菌药物治疗；③所有患者HPV 感染情况均由脱落细胞学检查确定；④阳性组患者此前未采取任何治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②有其他能够影响宫颈HPV 筛查的生殖系统疾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取方法 将液氮罐中的标本放置于-80℃冰箱中；用锡纸将研钵包好置于200℃的高压灭菌锅中消毒；将10、200、1000 μl 的移液枪枪头和1.5 ml 的离心管进行消毒备用；将组织自冰箱中取出,置于研钵中,将其敲碎30 mg 的组织,倒入液氮,进行研磨后移至EP 管中；后加入200 μl 的TL 缓冲液；加入25 μl OB 蛋白酶,充分混匀,在55℃温度条件下水浴孵育,每隔30 min 震荡1 次；离心(1000 r/min×5 min),取出不溶性组织沉淀,将上清液转移至无菌的1.5 ml EP 管中；加入220 μl BL 缓冲液,充分混匀。70℃孵育10 min；加入220 μl 无水乙醇,充分混匀；于2 ml 的收集管中组装HiBand DNA 柱子,将得到的裂解物转移到柱子中,置于离心机中进行离心(8000 r/min×2 min),弃去流下液体；将离心柱置于新的2 ml 收集管中,加入500 μl HB 缓冲液,离心(8000 r/min×2 min),弃去流下液体；将离心柱置于新的2 ml 收集管中,加入700 μl DNA 洗脱缓冲液,离心(8000 r/min×2 min),弃去流下液体,重复该步骤2 次；将离心柱放回2 ml的收集管中,离心(8000 r/min×2 min),从而使离心柱干燥；将离心柱置于无菌的1.5 ml EP 管中,加入100 μl 70℃的洗脱缓冲液,室温下静止3 min,离心(10000 r/min×1 min),洗脱DNA。将DNA 的洗脱液加入至离心柱中,离心(10000 r/min×1 min),于-20℃的冰箱中冻存。

1.3.2 基因甲基化检测引物设计 利用Epidesigner软件设计甲基化引物。检测基因的CpG 岛全序列,包括上下游添加序列。选择软件系统显示设计的甲基化引物,在反向引物5’端添加31 个bp 大小T7 启动子序列CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT,用于后续的体外转录；在正向引物5’端添加10 个bp 大小序列AGGAAGAGAG 以平衡聚合酶链式反应(PCR)。扩增产物长度为335～491 bp。亚硫酸氢盐修饰基因组PCR 扩增。采用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行鉴定。

1.3.3 体外转录及碱基特异性酶切 充分混匀后封好,4℃离心(1000 r/min×1 min),PCR 仪设定程序如下：37℃,20 min →85℃,5 min → 4℃,forever。

1.3.4 芯片点样及质谱检测 从384 孔板的裂解产物中抽取15 nl,加在SpectroCHlP 芯片上,于MassARRAY Compact System 上机检测。用EpiTYPER 软件分析MassARRAY 质谱仪收集的质谱图,后进一步进行甲基化定量分析。基因甲基化阳性率=基因甲基化阳性例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组PAX-1 基因甲基化的表达阳性率比较阳性组中PAX-1 基因甲基化的表达阳性率为96.67%(58/60),阴性组中PAX-1 基因甲基化的表达阳性率为83.33%(50/60),对照组中PAX-1 基因甲基化的表达阳性率为11.67%(7/60)。阳性组中PAX-1 基因甲基化的表达阳性率高于阴性组与对照组,且阴性组高于对照组,差异有统计学意义(χ2=5.926、87.306,P=0.015、0.000<0.05)。

2.2 PAX-1 基因甲基化检测结果与宫颈癌病理特征间的关系 PAX-1 基因甲基化检测结果与宫颈癌患者年龄、肿瘤大小、组织分化程度、FIGO 分期无关(P>0.05)。PAX-1 基因甲基化检测结果与宫颈癌患者淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 宫颈癌患者PAX-1 基因甲基化检测结果与宫颈癌病理特征的关系(n)

3 讨论

宫颈癌在妇科疾病中十分常见,其发病率在女性群体中仅仅低于乳腺癌,而近年来宫颈癌的发生率还呈现出上升的趋势,已经对广大女性群体的健康造成了十分严重的危害。宫颈癌的预后取决于其临床分期、分化情况,同时宫颈癌的远处转移是造成患者预后不佳最重要的决定因素［6,7］。关于宫颈癌的发生、发展的机制目前并不明确,多认为与基因、外界环境的共同作用有着密切的联系。而在宫颈癌的发生发展过程中,转移的发生是个较为漫长的过程,如果能在宫颈癌诊断早期即对其转移情况、转移倾向作出预测,这对于宫颈癌的治疗、预后预测都具有十分重要的意义［8］。

作为最常见的妇科肿瘤,宫颈癌的发病原因一直倍受国内外学者重视,1995 年,IARC 专题讨论会明确指出HPV 感染是宫颈癌发生的主要原因。目前关于HPV 致宫颈病变的机制还不十分清楚,但多数学者都认为HPV 导致宫颈发生病变的中心环节是HPV DNA与宫颈上皮细胞的整合。目前的研究显示HPV DNA常常整合到第3 号和13 号染色体上,具体多定位于3p14 与13q14,而13q14 是抑癌基因Rb 基因的位点,当HPV 的DNA 整合到Rb 基因位点时有可能会使Rb基因失活从而导致癌症的发生。也有研究指出除了整合到Rb 基因位点,HPV DNA 也能整合到PAX-1 的基因位点,PAX-1 基因是另一种抑癌基因,当HPV DNA整合到PAX-1 位点时能够促进其正常表达量减少从而致癌［8］。

其中基因的甲基化是一种减少正常表达量的重要机制,在DNA 的复制和修复中,DNA 甲基化可以保持细胞原有的信息；DNMT3A 和DNMT3B 的主要功能是催化未发生甲基化的CpG 双核苷酸从头甲基化。富含CpG 位点的区域形成CpG 岛,CpG 岛存在于大量的重复序列中(如逆转录转座子和端粒DNA)和大约 60%基因的启动子中［9］。重复序列中CpG 岛的甲基化对于维持染色体稳定性具有重要意义,绝大部分CpG 岛的甲基化模式在正常生长发育过程中保持不变,但是存在部分CpG 岛在发育过程中发生改变,例如生长发育中的基因组印记和X 染色体失活。目前对在不含CpG岛的启动子中的DNA 甲基化的认识水平还十分有限。研究显示,肿瘤细胞中DNA 甲基化修饰存在明显改变,表现为抑癌基因局部区域 CpG 岛高甲基化造成其表达沉默,此外全基因组DNA 低甲基化造成染色体结构稳定性降低,逆转录转座子、原癌基因的激活［10］。一项研究报道称,通过对比分析正常组织和结肠癌组织的DNA 甲基化水平,结果显示结肠癌组织的DNA CpG 岛的甲基化明显上升［11］。

本研究分析HPV 阳性的宫颈癌患者的PAX-1 基因甲基化情况发现,阳性组中PAX-1 基因甲基化的表达阳性率高于阴性组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PAX-1 基因甲基化检测结果与宫颈癌患者淋巴结转移有关(P<0.05)。

综上所述,PAX-1 基因甲基化在宫颈癌组织中呈高表达状态,而在HPV 阳性宫颈癌中表达呈更高状态,通过对PAX-1 基因甲基化水平的检测可以指导临床诊断、治疗宫颈癌。