褪黑素在脑缺血动物模型中的保护作用及其机制

凌 厉，李书鹏，张长宁，桂书彦，陈立波 (.华中科技大学协和深圳医院内分泌科，广东 深圳 5805；.北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院，广东 深圳 58055)

随着现代技术的进步和工业化时代的全面来临，缺血性脑卒中逐渐成为目前全球范围内最具破坏人类健康的重大疾病[1]。缺血性脑卒中一经发生，导致大脑产生严重的生理和神经损伤，这些损伤所带来的生理病理并发症很大程度上取决于脑血管闭塞发生的区域及类型[2]。这种脑血管的闭塞可以是永久性的，也可以是一过性的，无论何种类型的闭塞，都会严重影响血流向大脑的供应[3]，在缺乏营养供给的情况下，神经元很快经历了不可逆转的凋亡坏死，神经功能丧失[4]。脑缺血的病理生理级联反应已经被广泛认识，常见的机制包括氧化应激反应[5]、毒性神经递质释放[6]、免疫炎性细胞浸润等[7]。目前临床中常用的治疗手段只有溶栓，然而适应证较窄和治疗窗口短的特性极大地限制了溶栓药物在临床中的使用[8]。因此急需新的一线治疗药物。

据报道，内源性激素的损伤与多种疾病密切相关，如癌症[9]、心血管疾病和与年龄相关的神经退行性疾病等[10]。有文献显示脑卒中主要影响中老年人群，其机制可能与内源性激素缺乏相关[11]，如雌激素、孕酮、褪黑素等[12]。其中褪黑素的作用备受研究者关注。随着人类年龄的增长，褪黑素表达水平下降，导致人类脑卒中易感性提高[13]。褪黑素的神经保护作用可能与松果体和其他组织分泌的吲哚胺相关[14]。然而一些脑缺血动物模型的实验结果显示，其涉及的相关机制众多，目前已提出来的机制包括位置钙离子稳态，抑制炎性反应，降低氧化应激反应，调节小胶质细胞的功能等[15]。总而言之，褪黑素的这些有益作用主要归因于其亲脂特性，可以快速向大脑进行传输，另一方面，褪黑素受体也在大脑中广泛分布，与钙调蛋白等多种胞内蛋白相互作用，关系紧密。褪黑素与这些蛋白等结合进一步放大了其保护效应[16]。

过去围绕着褪黑素参与氧化应激反应的机制展开了大量研究，相关通路信号分子包括PI3K/Akt、增殖蛋白激酶(MAPKs),氧化应激相关因子2 (Nrf2)等，然而针对这些作用通路的药物研究未能转化为有效的临床成果，因此，褪黑素的神经保护作用机制有待进一步阐明。本文探究脑缺血过程中褪黑素通过MAPK通路参与氧化应激诱导的炎性反应作用机制，阐明褪黑素对脑卒中的神经保护作用，为临床中的进一步转化应用提供有力证据。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组：选取SD雄性大鼠，体重250～300 g，8～10周龄，分为四组，每组12只，分别为假手术组、脑缺血组[大脑中动脉闭塞(MCAO)手术]、褪黑素+脑缺血组(褪黑素治疗组)以及褪黑素(Mela)+假手术组(褪黑素预处理组)。褪黑素治疗组在脑缺血建模前给药，以5 mg/kg剂量溶于生理盐水中，腹腔注射。实验中共计7只实验动物死亡，4只来自缺血组，3只来自褪黑素治疗组，死亡原因包括脑水肿，血脑屏障破坏等。通过补充更多实验动物以进行调整。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2MCAO模型构建：大鼠麻醉后仰卧于显微镜下，消毒、备皮，于颈部正中做一切口，皮下钝性分离，沿右侧胸锁乳突肌向下找到颈动脉，小心分离颈动脉鞘，继而分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，最后结扎颈总动脉和颈外动脉。分离过程中注意勿触碰迷走神经。使用动脉夹将颈内动脉夹闭并用眼科剪刀在颈总动脉剪一小口，插入线栓并小心结扎。手术过程中检测实验动物肛温，麻醉苏醒后将实验动物置于饲养室，若动物出现站立不稳提尾时转圈等症状说明建模成功。建模成功24 h后取材进行后续实验。

1.32，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：建模后实验动物脊髓离断，心脏灌流，取脑组织，从额叶或枕叶开始连续做2 mm冠状切片，将切片置于刚制备的2%TTC溶液中，室温染色1 h。将切片在4%多聚甲醛中固定，拍照并测定梗死面积。

1.4HE染色：将组织切片进行脱蜡处理，经二甲苯处理、再用分级酒精溶液重新水化(从100%到70%，每次洗涤5～10 min)。随后将载玻片用蒸馏水冲洗以清除残留乙醇，并在室温下浸泡苏木素10 min。蒸馏水洗净载玻片,在显微镜下观察,以确保核染色，若染色未完全则增加苏木素处理时间。使用Image J软件对神经元死亡和存活程度进行分析。

1.5Western印迹：提取脑组织蛋白离心后，取上清液仔细分离。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。调整蛋白质样品浓度至30 μg，电泳后转移到聚偏氟乙烯PVDF膜上。封闭后将 PVDF与一抗置于冰箱中过夜孵育。次日加二抗。ECL检测试剂检测X射线条带。所使用的抗体包括抗-p-JNK、抗-JNK、抗-Nrf2、抗-HO-1、抗-Trx和β-actin，抗体稀释浓度为1∶1 000。

1.6统计学分析：采用SPSS22.0版本版件进行t检验。

2 结果

2.1褪黑素预处理对脑缺血的影响：将小鼠分为假手术组、脑缺血组和褪黑素治疗组，TTC结果显示褪黑素治疗后显著减少小鼠的脑缺血体积(P<0.05),见图1。缺血性损伤导致神经元的损伤可能是由于梗死区血流量骤降和ATP供应严重耗竭而导致的坏死，也可能是由于梗死区周围半暗带区的细胞凋亡所致。根据大脑位置的不同，坏死和凋亡细胞死亡之间存在广泛的干扰，多由谷氨酸和活性氧等活性因子触发。接下来我们选择梗死周围区域作为感兴趣区进行形态学分析。HE染色显示额叶皮质和纹状体的神经元损伤程度。与假手术组相比，脑缺血组小鼠脑皮质的神经纤维束表现出明显的异常形态特征。然而，褪黑素治疗在很大程度上减轻了这种损害(P<0.05)。缺血后同侧皮质和纹状体的特征包括神经元扇形结构样，伴有轻微的染色改变、空泡形成和中性粒细胞浸润。见图2。

注：与假手术组比较，①P<0.001;与脑缺血组比较，②P<0.05图1 脑缺血组和褪黑素预处理组脑组织TTC染色及统计

注：与假手术组比较，①P<0.001;与脑缺血组比较，②P<0.05图2 脑缺血后皮质区及纹状体区HE染色和中性粒细胞浸润(40×)

2.2褪黑素预处理对MCAO介导的MAPK-p38/p-JNK通路转归的影响:MCAO损伤后p-JNK和p-P38的表达高于假手术组。褪黑素预处理后MCAO介导的应激相关MAPK p-P38/p-JNK通路的上调显著下降(P<0.05)。见图3。

注：1～4：脑缺血组、褪黑素治疗组、假手术组、褪黑素预处理组

注：与假手术组比较，①P<0.001,②P<0.01;与脑缺血组比较，③P<0.05图3 皮质和纹状体区脑缺血后p-38,p-p38,JNK和p-JNK的表达

2.3褪黑素对内源性抗氧化剂Nrf2/HO-1/Trx通路的作用:MCAO处理24 h后Nrf2和HO-1的表达较假手术组增高(P<0.05)。见图4。Trx在脑缺血后表达下调，而褪黑素治疗显著恢复了Trx的表达水平。值得注意的是，没有观察到褪黑素治疗组的Nrf2的表达水平有任何影响(P>0.05)。见图4。

注：1～4：脑缺血组、褪黑素治疗组、假手术组、褪黑素预处理组

注：与假手术组比较，①P<0.001,②P<0.01;与脑缺血组对比，③P<0.05，④P<0.01图4 皮质和纹状体区脑缺血后Nrf2、HO-1和Trx的表达

3 讨论

本次研究探究了内源性神经激素褪黑素对MCAO诱导的脑缺血的保护机制，是既往研究的延伸，进一步证明了褪黑素的作用机制。本次研究主要应用蛋白质组学的方法，探究了褪黑素在脑缺血发生后对集中纹状体蛋白的调节作用。褪黑素在各种病理和疾病条件下都被认为是一种内源性强抗氧化剂、自由基清除剂和内源性抗氧化酶的调节剂[17]，早期研究报道了氧化应激反应和炎性反应过程的交叉互作[18]，因此，围绕褪黑素展开的治疗的目标应该多通过刺激抗氧化酶来调节和减轻神经炎性反应和氧化应激的积累。实际上，褪黑激素与多种抗氧化系统的激活有关，因此有助于维持大脑内的平衡环境[19]。特别是褪黑激素可以激活谷胱甘肽和Nrf2/HO-1通路等的研究，已被业内广泛熟知。此外，有研究表明褪黑激素通过激活Sirt1、Sirt3、Sirt6和其他抗氧化途径和介质在能量缺乏和细胞生存相关的细胞过程中发挥重要作用[20]。研究表明，天然衍生的多酚类物质的抗氧化作用涉及Sirt1-Nrf2通路的激活[21]。同样，褪黑激素作为一种有效的抗氧化剂和内源性神经保护神经激素，也可以激活Sirt1-Nrf2通路[22]。虽然氧化应激反应和炎性反应虽然是脑缺血过程中的重要病理级联反应过程，围绕褪黑素的抗氧化应激效应的研究也已开展多年，但在脑缺血的临床治疗中仍未得到良好的成果转化。

首先，褪黑素的脑缺血保护作用毋庸置疑，在本次研究中也得到了验证。研究表明MCAO模型梗死区通常涉及纹状体区域，神经元的坏死大多也发生在该部位，TTC染色结果显示该区域在脑缺血发生后呈白色，代表血流供给中断和细胞的坏死。然而褪黑素处理后梗死区显著降低，说明了褪黑素的潜在保护作用。以前的研究介绍了褪黑素针对脑卒中的多种保护功效，大多数围绕其减轻活性氧自由基(ROS)介导的氧化应激反应和炎性反应等展开论述，多项脑缺血模型实验结果表明褪黑素因下调核因子(NF)-κB、环氧化酶(COX)-2和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达而具有抗炎潜力，然而针对这些通路的临床转化效果不如预期，因此还需要更多的实验探究褪黑素参与脑缺血的作用机制。本研究中关注到褪黑素通过MAPK-p38/p-JNK信号通路参与脑缺血保护的作用机制。褪黑素可以通过下调MAPK通路信号蛋白的表达起到神经保护的作用。研究表明MAPK/JNK/p-38信号通路主要参与机体的炎性反应，降低该信号通路分子的表达可以通过减少iNOS和COX2分子产生ROS，进而减少脑缺血后的梗死面积。本研究结果显示，褪黑素处理后，JNK以及p-38蛋白表达水平显著下降，说明褪黑素可能通过该信号通路起到减少梗死体积，保护神经功能的作用。本研究还关注了褪黑素对Trx表达的影响。Trx蛋白是一种可以调节氧化还原反应的关键作用蛋白，本文结果显示褪黑素预处理的条件下可以显著提高Trx的表达水平，进一步支持了褪黑素在缺血性损伤中的抗氧化作用，补充了褪黑素的作用机制。

综上所述，内源性抗氧化剂和昼夜节律调节剂褪黑素预处理对缺血性脑损伤有保护作用，相关机制包括对如氧化应激相关激酶和神经炎性反应的调节，补充内源性抗氧化神经激素褪黑素将通过调节将MAPK p-P38/pJNK信号通路、 Trx蛋白的表达减轻脑缺血的神经损害。