天津野生山樱花组织培养与再生体系的建立

高英，刘昊，杨利云，杨翔祥，夏蕊，杨丽芳

（1.天津农学院园艺园林学院，天津 300392；2.天津市农业科学院林业果树研究所，天津 300384）

山樱花（Cerasus serrulate L.）又名山樱、野山樱，属于蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）植物，是樱花的野生种，为落叶小乔木。我国北方地区罕见野生山樱花分布，2018年在天津蓟州八仙山国家自然保护区首次发现野生种群，是适合当地环境的地理变异类型。该种野生山樱花树型优美，花型独特，花瓣倒卵形，先端有凹缺，花瓣白色，部分先端呈淡粉色，具有较强的抗病虫害能力、适应性和抗逆性，蕴含重要的樱花基因资源，是重要而稀少的樱属观赏植物和种质资源，具有潜在的开发利用前景［1，2］。目前，北方野生山樱花的繁殖方式主要以实生繁育为主，无性繁殖受制于砧穗亲和性和插条发育程度还存在繁育率低和苗木整齐度差等问题，限制了野生山樱花的资源保护及开发利用。

植物组织培养技术不仅具有繁殖快、成苗周期短的优点，而且能够保持优良遗传性状的稳定性，可以为山樱花快速繁殖和资源保存提供有效途径［3－5］。已有研究建立了多种樱属植物的组培快繁体系［6－12］，但对野生樱花的研究均是南方分布区的福建山樱花和钟花樱［13－15］，对北方野生山樱花资源的研究尚处于起步阶段。本研究在借鉴多种樱花组培快繁研究的基础上，以采集于天津市蓟州山区的野生山樱花为试材，对丛生芽增殖和生根诱导培养的激素组合以及炼苗时长和移栽基质等进行筛选试验，以期建立该野生山樱花的组培快繁体系，为其资源保护和有序利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验树为天津市蓟州山区的野生山樱花（Cerasus serrulate L.）成龄树。于2020年5月抽生新梢后，剪取5.0～6.0 cm半木质化嫩梢进行组织培养。

1.2 外植体消毒和茎段腋芽诱导

用洗涤剂洗去新采嫩梢表面污渍，剪掉叶片，保留叶柄1～2 cm，用流水冲洗2 h后，在超净台上将嫩梢浸入70%乙醇溶液中30 s，用无菌水冲洗2～3次，再放入0.3%过氧乙酸溶液中消毒2次，每次10 min，期间不断摇动或搅拌；用无菌水清洗3～4次，再用无菌滤纸吸干水分。剪取1.0～2.0 cm的带芽茎段，接种在添加2 mg·L－16－苄氨基腺嘌呤（6－BA）和0.1 mg·L－1萘乙酸（NAA）的MS培养基上，进行腋芽诱导。

1.3 丛生芽高效增殖培养的激素组合筛选

待诱导出的腋芽长至1.0～1.5 cm时，将萌发的新梢剪下，接种到添加不同种类、不同浓度激素的丛生芽增殖培养基中进行增殖培养。本试验在已有研究基础上，以MS为基本培养基，确定NAA浓度为0.1 mg·L－1，另外选择6－BA、TDZ和GA3，分别设计不同浓度，形成多个处理组合，见表1。每瓶接入5个茎段，每个处理共接种24瓶，3次重复，培养30 d后统计长度大于5 mm的丛生芽数量，计算增殖系数和玻璃化率［13］。

表1 丛生芽增殖培养基添加激素的种类及浓度

增殖系数＝平均每瓶30天内形成的有效芽苗数／接种腋芽数；

玻璃化率（%）＝培养30天后的玻璃化芽苗总数／培养30天后的有效芽苗总数×100。

1.4 组培苗生根诱导培养基的激素浓度及支撑物筛选

待上述丛生芽长至3.0～4.0 cm时进行生根诱导培养。本试验以1／2MS为基本培养基，设计支撑物为7.0 g·L－1琼脂或2.5 g干水苔、添加IBA和NAA的浓度配比7种（表2），另添加15 g·L－1蔗糖，调pH至6.0，在16 h光培养、8 h暗培养、光照强度2 000～3 000 lx、（25±2）℃、空气相对湿度50% ～60%条件下培养。每瓶接种3个芽苗，每个处理共接种24瓶，3次重复。培养30 d后调查单株不定根数、单株侧根数及生长状况。

表2 生根培养基添加激素的种类及浓度 （mg·L－1）

1.5 移栽基质与炼苗时长的确定

当上述生根培养基中组培苗不定根长约为5.0 cm时，进行移栽。栽前，在室温（23～25℃）自然光照条件下，对组培苗进行闭瓶炼苗，移栽前一天打开瓶盖。移栽时，用镊子从培养瓶中小心取出组培苗，用清水洗净根上黏附的培养基，然后在百菌清500倍液中蘸根1～2 min，栽入已备好的育苗盘基质中。

试验设置4种育苗基质：蛭石＋珍珠岩＋草炭（体积比2∶1∶1）、蛭石＋草炭（体积比2∶1）、草炭＋珍珠岩（体积比1∶1）和营养土＋珍珠岩＋草炭（体积比2∶1∶1）；炼苗天数设置0、5、10 d。每处理3次重复，每重复移栽组培苗30株。于移栽第30天统计组培苗成活情况。

1.6 数据处理与统计分析

利用Microsoft Excel 2010对试验数据进行整理，采用SPSS 25.0进行方差分析，用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同种类激素组合对野生山樱花丛生芽增殖的影响

由表3可知，仅添加6－BA与仅添加TDZ的丛生芽增殖系数分别以0.50 mg·L－1和2.00 mg·L－1时最高，分别为2.25和2.46，但两者之间及各浓度处理之间均无显著差异。而增添GA3能够提高增殖系数，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z15）的增殖系数最大，为3.96，其次为0.25 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z9）、1.00 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z11）和0.50 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z14），增殖系数在3.15～3.28范围内，4种组合间无显著差异。但Z15、Z14、Z11的玻璃化率显著低于Z9（95%），分别为6%、7%、14%，远低于其他激素组合。仅添加6－BA或TDZ的芽苗叶片增大明显且嫩绿但玻璃化率高且程度深，轻微程度平均占比分别达到0.40和0.29，严重程度平均占比分别达到0.17和0.12；增添GA3的芽苗叶片大且黄绿，但玻璃化程度明显降低，轻微程度平均占比分别降至0.38和0.22，严重程度平均占比分别降至0.05和0.02。

表3 不同种类激素组合对野生山樱花丛生芽增殖的影响

综合分析，Z15激素组合，即1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ ＋0.1 mg·L－1NAA更适宜于天津野生山樱花茎段的增殖生长。各种生长情况的增殖苗见图1。

2.2 不同生长素组合及不同培养基支撑物对野生山樱花组培苗生根的影响

2.2.1 不同浓度IBA对生根的影响 由表4可知，在固定NAA浓度为0.10 mg·L－1的前提下，以琼脂为培养基支撑物时，添加0.75 mg·L－1IBA（S4）的野生山樱花组培苗单株侧根数最多，组培苗生长健壮，但生根率低，仅40.00%；而添加0.25 mg·L－1IBA（S2）的生根率最高，达75.00%，单株不定根数和单株侧根数均较高，生根效果最好，且组培苗生长较健壮。以水苔为培养基支撑物时，添加0.10 mg·L－1IBA（S1）的生根率、单株不定根数、单株侧根数均最高，分别达94.59%、3条、10条，均显著高于其他处理，生根效果最好，且组培苗生长很健壮。

表4 不同浓度IBA对野生山樱花生根和生长状况的影响

2.2.2 不同浓度NAA对生根的影响 由表5可知，当固定IBA浓度为0.10 mg·L－1时，在以琼脂为支撑物的培养基中添加0.25 mg·L－1NAA（S5）时，野生山樱花组培苗的生根率最高，达91.30%，单株不定根数最多（9条），显著多于其他处理，单株侧根数较少，组培苗生长很健壮；在以水苔为支撑物的培养基中添加0.10、0.50、0.75 mg·L－1NAA的生根率均超过90%，以添加0.10 mg·L－1NAA（S1）的值最高，且其单株不定根数、单株侧根数均明显高于其他处理，组培苗生长很健壮。

表5 不同浓度NAA对野生山樱花生根和生长状况的影响

综合上述分析，以水苔为支撑物、添加0.10 mg·L－1IBA＋0.10 mg·L－1NAA的1／2MS培养基最适宜野生山樱花组培苗生根。组培苗的不同生根情况见图2。

图2 野生山樱花组培生根

2.2.3 不同支撑物对组培苗根形态的影响 由图3可知，以琼脂为支撑物的组培苗根呈白色，表面有透明物质包裹（图3A）；而以水苔为支撑物的组培苗靠近根尖部分呈黄白色，靠近茎基部呈黄褐色，表面无透明物质（图3B）。在显微镜下观察，以琼脂为支撑物培养的组培苗根系表面光滑（图3C），而以水苔为支撑物培养的组培苗根系表面密布根毛（图3D）。另外，比较两种支撑物上的组培苗发现，以琼脂为支撑物的组培苗茎基本没有变化，而以水苔为支撑物的组培苗茎有一定的伸长。

图3 不同培养基支撑物的组培苗生根情况

2.3 不同基质对野生山樱花移栽成活率及幼苗生长的影响

由表6可知，基质为蛭石＋珍珠岩＋草炭时野生山樱花的移栽成活率最高，达98.21%，显著高于其他基质处理；基质为营养土＋珍珠岩＋草炭和草炭＋珍珠岩的组培苗成活率次之，分别为82.14%和76.79%，二者间差异不显著。

表6 不同基质对野生山樱花移栽后生长的影响

移栽成活植株叶片数量整体有所减少，其中蛭石＋珍珠岩＋草炭和草炭＋珍珠岩处理的叶片减少1片，而其余两种基质处理的叶片减少3～4片。叶片减少主要是因为移栽后基部老叶脱落，而顶部新叶尚未发出。

移栽后野生山樱花的茎粗基本无变化，株高增加不明显，但冠幅明显增加。不同基质处理间，蛭石＋珍珠岩＋草炭的株高增量最大，为2.64 mm，其次为营养土＋珍珠岩＋草炭，两者间差异不显著；营养土＋珍珠岩＋草炭的冠幅增量最大，达43.62 mm，草炭＋珍珠岩（36.58 mm）和蛭石＋珍珠岩＋草炭（35.68 mm）次之，蛭石＋草炭最低（27.99 mm）；不同基质处理间茎粗增量差异没有显著差异。

综合各指标，以蛭石＋珍珠岩＋草炭（体积比2∶1∶1）为基质较适宜野生山樱花组培苗移栽成活。

2.4 不同炼苗时间对野生山樱花移栽成活率及幼苗生长的影响

由表7可知，炼苗能明显提高组培苗的移栽成活率，以水苔为生根培养基支撑物的组培苗移栽成活率更高，炼苗5 d移栽成活率达80%，与炼苗10 d的成活率不存在显著性差异。移栽成活幼苗的叶片数量整体有所减少（0～2片），茎粗基本无变化；株高增加1.73～3.87 mm，以水苔为支撑物炼苗10 d的增量最大，但与炼苗5 d的株高不存在显著性差异；冠幅明显增加，增量为20.89～33.31 mm。综合分析，以水苔为生根培养支撑物、炼苗5 d较适宜野生山樱花组培苗移栽成活，且移栽后生长状况较好。

表7 不同炼苗时间对野生山樱花移栽后生长情况的影响

3 讨论

细胞分裂素与生长素的比值决定了芽和根的分化，细胞分裂素在芽的增殖和生长中起决定性作用［15］。6－BA和TDZ是组织培养中常用的细胞分裂素类物质，对植物的形态发生起有效调节作用，应用范围遍及草本植物到木本植物［16］。在樱属植物再生的研究中，TDZ对诱导酸樱桃［17］离体器官产生不定芽具有较强的活性，而6－BA对诱导马哈利樱桃［18］离体叶片再生更有效。本研究发现，在野生山樱花茎段增殖时使用6－BA或TDZ均出现了不同程度的组培苗玻璃化现象，玻璃化率最高达到87%，这与前人在山樱花［3］上的试验结果一致；使用6－BA虽然繁殖系数较高，但组培苗仍有节间短的现象。在培养基中添加GA3可以明显增加垂枝樱花的增殖系数［19］，GA3浓度达到0.3 mg·L－1对福建山樱花丛生芽增殖有明显促进作用［20］。本研究也发现，增添GA3能明显提高野生山樱花的增殖系数，降低不定芽玻璃化率，改善节间短的现象，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ＋0.1 mg·L－1NAA对野生山樱花丛生芽增殖的效果最好。

IBA和NAA是诱导木本植物不定根形成的重要植物生长调节剂［21，22］，作用效果存在品种差异性，如在微毛樱生根培养基中添加0.5 mg·L－1IBA可有效诱导组培苗生根且生根率最高可达100%［7］，而在樱花生根培养基中添加1.0 mg·L－1IBA才显著提高组培苗的生根率［4］。对福建山樱花的研究发现，IBA和NAA配合使用可显著提高其根系形成速率，且根系生长粗壮，当两者配比为1.0 mg·L－1NAA＋1.0 mg·L－1IBA时，生根率达90%以上［14］。本研究也证实两种生长素配合使用可以促进野生山樱花组培苗不定根的形成，但适宜的浓度相对较低，0.10 mg·L－1NAA＋0.10 mg·L－1IBA的生根表现最好，生根率最高达到94.59%，单株不定根数为3条，单株侧根数可达10条，植株生长很健壮。本研究结果也表明野生山樱花不定根发生属于诱导生根型，且对生长素较敏感。

本研究使用水苔作为培养基支撑物，在高等木本植物的组织培养中尚属罕见，结果表明水苔较琼脂对野生山樱花的生根效果有明显改善，生根率更高，显微镜下可观察到侧根上长出了根毛。

移栽基质及炼苗时长对组培苗的移栽成活起着关键作用。本研究结果表明添加了珍珠岩的基质对野生山樱花的移栽成活率具有明显提高作用，这与在日本晚樱［23］上的试验结果相似。有研究表明草莓闭瓶炼苗3 d，猕猴桃闭瓶炼苗3～5 d、开瓶炼苗2 d，大樱桃开瓶炼苗10～15 d均可提高其组培苗的移栽成活率［24－26］。本研究结果也发现，增加炼苗时长有利于野生山樱花组培苗移栽成活，但采用水苔做培养基支撑物可大大缩短炼苗时长且提高成活率，这可能与水苔营造的暗生长环境和溶氧量较高有利于侧根根毛发生有关。

4 结论

天津野生山樱花丛生芽增殖的最佳培养基为MS＋0.50 mg·L－1TDZ＋1.00 mg·L－1GA3＋0.1 mg·L－1NAA，最佳生根培养基为用水苔作为支撑物的1／2MS＋0.10 mg·L－1IBA ＋0.10 mg·L－1NAA，最佳移栽基质为蛭石＋珍珠岩＋草炭（体积比2∶1∶1），移栽前闭瓶炼苗5 d。野生山樱花组培体系的建立为其大量快速繁殖奠定了基础。