刺槐Kuntiz型胰蛋白酶抑制剂基因（RpKTI）的克隆及表达分析

张晓静，董启迪，王霞，张晓娜，周建，3

（1.河南科技学院园艺园林学院，河南 新乡 453003；2.长垣市林业局，河南 长垣 453400；3.河南省园艺植物资源利用与种质创新工程研究中心，河南 新乡 453003）

胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor，TI），即抗胰蛋白酶因子（antitrypsin），属于蛋白酶抑制剂四大分类中的丝氨酸蛋白酶抑制剂［1］。TI在动植物及微生物中均有发现，最早提取于牛胰腺［2］，后来又在大豆中分离出Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）［3］。对植物TI的研究主要集中于豆科，但在茄科、禾本科以及十字花科中也有发现［4，5］。

目前，对KTI的研究较为深入［6－8］，分子量在21 kDa左右，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，在植物抗性研究中的作用极其重要，主要涉及对生物逆境与非生物逆境的响应，如盐胁迫、抗虫能力等［9］。高越峰等［10］得到的转基因（大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因，SKTI）烟草植株具有明显的抗棉铃虫能力。谢可方等［11］发现大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（SBTi－A2）对棉铃虫幼虫生长有一定的抑制作用；大豆根系的胰蛋白酶抑制剂（STI）能阻碍大豆胞囊线虫的发育［12］。Srinivasan等［13］克隆了烟草胰蛋白酶抑制剂基因（NtPI），发现转基因烟草相比野生型烟草对NaCl的耐受性更强；在pH值为4～8之间可正常生长；对斜纹夜蛾和棉铃虫有一定的抗性，表明烟草NtPI基因具有多重抗胁迫性。向缅［14］将克隆得到的决明Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因2（COTI2）转入拟南芥并进行盐胁迫及干旱胁迫处理，发现转基因拟南芥抗盐及抗旱能力均优于野生型。

TI的作用广泛，通过转基因技术可以极大地提高转基因植株对逆境胁迫的抗性响应。但目前在刺槐中的研究并不多，尤其是有关非生物逆境胁迫响应的相关研究报道较少。

刺槐为豆科刺槐属落叶乔木，是重要的生态保护木本植物，有很强的抗旱、耐瘠薄、耐盐碱、耐铅镉能力，对土壤改良有重要意义［15，16］。由于其根蘖及枝条萌发能力强，因此多与其他树种组成混交林用于保土固沙，成为防护造林、生态修复必不可少的物种之一。我国土壤质量差，污染问题越来越严峻，尤其是重金属污染，严重危害人类健康［17］。因此，对重金属污染的修复极其重要。本试验在铅镉胁迫下提取并克隆得到刺槐Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（RpKTI），并对其进行生物信息学分析及表达分析，为后期RpKTI基因的功能验证、应用及其种质资源创新等方面的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用植物材料为刺槐（Robinia pseudoacacia L.）；大肠杆菌（Escherichia coli））感受态细胞DH5α；载体为pMD18－T（Takara）。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取 采用改良CTAB法［18］提取刺槐叶片的总RNA，利用NanoDrop 2000C分光光度计检测浓度，并采用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将其反转录成cDNA。

1.2.2 刺槐KTI基因的克隆 刺槐KTI基因的克隆采用SMARTer RACE 5′／3′Kit（Takara，Code No.634858）试剂盒进行。核心目的片段由本课题组前期对刺槐的转录组测序数据分析获得。根据核心片段分别设计内外引物（表1）进行3′端和5′端的扩增，扩增体系如表2。按照试剂盒说明书合成RACE Ready cDNA作为第一轮扩增模板，扩增引物为外引物，第二轮扩增体系的模板为稀释后的第一轮扩增体系产物，扩增引物为内引物。扩增程序均为95℃1 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃30 s，35个循环；68℃3 min。将获得的PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带切胶回收纯化后连接到载体pMD18－T，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单菌落摇菌后进行PCR检测，选择阳性克隆菌落送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将3′端和5′端扩增序列片段通过DNAMAN 6.0进行拼接，设计CDS区扩增引物，并克隆全长，扩增体系如表3，扩增程序同上。

表1 刺槐KTI基因克隆的引物序列

表2 3′／5′－RACE PCR扩增体系

表3 刺槐KTI基因全长PCR扩增体系

1.2.3 刺槐KTI基因的生物信息学分析 利用ORF finder分析RpKTI基因的开放阅读框；Prot-Param及ProtScale在线程序对其基本理化性质及亲／疏水性进行预测；通过TMHMM 2.0（Tiedmixture Hidden Markov Models）分析RpKTI基因编码蛋白的跨膜结构域；SignalP－4.1分析其信号肽位点；在线工具NetPhos 3.1及NetNGlyc 1.0分析RpKTI基因编码蛋白的磷酸化及糖基化位点；SOPMA在线分析预测该蛋白的二级结构；建模软件SWISS－MODEL对RpKTI基因编码蛋白的氨基酸序列同源建模得到蛋白质的三维结构模型；通过NCBI Conserved Domain Search分析RpKTI基因的保守结构域；利用DNAMAN 6.0及MEGAX软件分析刺槐及其他豆科植物的KTI基因编码蛋白的同源性，从而构建系统进化树（表4）。

表4 生物信息学分析工具及其网址

1.2.4 刺槐KTI基因的组织表达分析 将刺槐幼苗于铅（2 000 mg／kg）、镉（80 mg／kg）胁迫下分别处理3 d及45 d，以不作处理的植株为空白对照（0 d）。取刺槐幼苗叶片迅速放入－80℃液氮中冻存，并进行RNA提取及反转录试验。

根据KTI基因的全长序列，以刺槐Actin基因为内参，使用NCBI中的Primer designing tool设计实时荧光定量PCR（qRT－PCR）引物（F：5′－TTTCCCAAGAGAATGGGTGGG－3′，R：5′－GGTGGAGCAGTGATTGTGGG－3′），扩增大小为135 bp。扩增体系（10μL）：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）5μL，引物各0.5μL，cDNA 0.5μL，ddH2O 3.5μL。扩增程序为：95℃30 s；95℃5 s，50℃30 s，共40个循环；95℃5 s，65℃5 s，95℃5 s。采用2－ΔΔCt算法计算KTI基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 刺槐KTI基因全长的克隆及ORF预测

通过对刺槐KTI基因3′端和5′端进行PCR扩增，得到3′端序列长度约500 bp，5′端序列长度约为400 bp（图1a）。测序结果显示KTI基因长度为633 bp（图1b），经过拼接得到刺槐KTI基因序列全长为745 bp（图2），将此基因命名为RpKTI。通过开放阅读框ORF预测（图3），RpKTI基因共编码210个氨基酸，起始密码子为ATG，该序列的最后一个密码子为GTT，终止密码子为TGA。编码区两侧为11 bp（735～745 bp）的5′端非翻译区和101 bp（1～101 bp）的3′段非翻译区。

图1 刺槐KTI基因的PCR扩增

图2 刺槐KTI基因拼接序列全长

图3 刺槐KTI基因的开放阅读框（a）及氨基酸序列（b）分析

2.2 RpKTI基因的基本理化性质

RpKTI基因共编码210个氨基酸，其中含有不带电荷的极性亲水氨基酸（Y、S、T、C、N、Q）50个，占比23.8%；非极性疏水氨基酸（A、G、V、L、I、P、F、M、W）119个，占比56.7%；酸性氨基酸（D、E）25个，占比11.9%；碱性氨基酸（K、H、R）16个，占比7.6%。甘氨酸（Gly）数量最多，占全部氨基酸的11.4%（表5）。理论等电点PI为4.51，相对分子质量为22 763.87 Da，原子总数3 195，分子式为C1039H1586N258O307S5。不稳定系数（instability index）为38.81（<40），脂肪系数为89.05，总平均亲水性（GRAVY）值为0.072。因此，预测此蛋白是一个稳定的酸性疏水蛋白。

表5 RpKTI基因编码蛋白的氨基酸组成

2.3 RpKTI基因编码蛋白的亲／疏水性预测

通过在线ProtScale工具对RpKTI基因编码蛋白的亲／疏水性进行预测。由图4可知，在氨基酸序列的第12位亮氨酸（Leu）具有最大值2.8，疏水性最强，肽链的第182位谷氨酸（Glu）具有最小值－3.2，亲水性最强。整体看疏水氨基酸与亲水氨基酸分布较为均匀。结合ProtParam预测结果，此蛋白为疏水蛋白。在第13位氨基酸位置出现一个较强的疏水区域（score＞1.5），推测此位置可能存在一个跨膜结构。

图4 RpKTI基因编码蛋白的亲／疏水性

2.4 RpKTI基因编码蛋白的跨膜结构域预测及信号肽分析

通过TMHMM对RpKTI基因编码蛋白的跨膜结构域进行预测，结果（图5a）表明，RpKTI基因编码蛋白可能存在1个跨膜结构域，此跨膜结构位于氨基酸序列N－端的第3～23位氨基酸，由膜内到膜外，且可能含有信号肽。经过SignalP－4.1分析发现，该蛋白中存在信号肽，信号肽切割位点位于第25位氨基酸（即C值最高点，图5b）。1～24位氨基酸为此蛋白的信号肽区域，信号肽序列为MKPAFITLSFLLFAFITNLQLTFS。

图5 RpKTI基因编码蛋白的跨膜结构域（a）和信号肽位点（b）

2.5 RpKTI基因编码蛋白的磷酸化位点及糖基化位点

蛋白质翻译后的磷酸化及糖基化分析结果表明RpKTI基因编码蛋白有11个磷酸化位点（图6a），其中有7个丝氨酸（Ser）位点、3个苏氨酸（Thr）位点和1个酪氨酸（Tyr）位点。N－糖基化位点位于第65位氨基酸天冬酰胺（Asn，图6b）。

图6 RpKTI基因编码蛋白的磷酸化位点（a）和糖基化位点（b）

2.6 RpKTI基因编码蛋白的二级结构预测

SPOMA分析结果（图7）表明，RpKTI基因编码蛋白的二级结构由31个氨基酸构成α－螺旋（alpha helix；14.76%），32个氨基酸构成β－转角（beta turn；15.24%），68个氨基酸构成延伸链（extended strand；32.38%），以及79个氨基酸构成无规则卷曲（random coil；37.62%）。在此蛋白的二级结构中，以延伸链和无规则卷曲为主。

图7 RpKTI基因编码蛋白的二级结构

2.7 RpKTI基因编码蛋白的三维结构同源建模

建模结果（图8）表明，第27～203位氨基酸参与建模，以5xoz.1.A为模板，两者一致性可达66.85%，GMQE值为0.77。从图8a可知，此蛋白主要是由无规则卷曲及延伸链构成，与二级结构预测结果一致。拉式图（Ramachandran Plots）的Ramachandran Favoured值为92.57%，表明预测构象合理可用（图8b）。

图8 RpKTI基因编码蛋白的三维结构（a）和拉式图（b）

2.8 RpKTI基因编码蛋白的系统进化树

通过对RpKTI基因编码蛋白进行Blastp比对（图9），此蛋白氨基酸序列中具有STI［soybean trypsin inhibitor（Kunitz）family of protease inhibitors］结构域，属于STI超级家族。选取相思子（Abrus precatorius）、黧豆（Mucuna pruriens）、蔓花生（Arachis duranensis）、花生（Arachis hypogaea）、木豆（Cajanus cajan）、豌豆（Pisum sativum）6种与刺槐同源性较高的豆科植物KTI基因氨基酸序列，采用DNAMAN软件进行多序列比对，同源性为72.64%，由图10可知，KTI基因在豆科植物中相对保守。

图9 RpKTI基因编码蛋白的保守结构域

图10 RpKTI基因的氨基酸序列与其他植物KTI的同源比对

通过MEGA－X软件的邻位归并法（Neighborjoining，NJ）对豆科植物Kuntiz型胰蛋白酶抑制剂基因（KTI）构建系统进化树（图11），发现刺槐与蒺藜苜蓿位于同一分支，亲缘关系较近，而与鹰嘴豆（Cicer arietinum）、蔓花生（Arachis duranensis）及花生（Arachis hypogaea）的亲缘关系较远。

图11 豆科植物KTI基因的系统进化树

2.9 RpKTI基因的相对表达量

如图12所示，在铅镉混合胁迫时，随处理时间的增加，RpKTI基因的表达量先增加后下降，在混合胁迫处理3 d时基因的相对表达量达到最高，约为对照（0 d）的3倍，而在混合胁迫45 d时又明显下降。

图12 铅镉混合胁迫下RpKTI基因的相对表达量

3 讨论与结论

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂广泛存在，在豆科植物中的含量最多，目前已在多种植物中进行了分离及深入研究，如大豆、杨树、烟草等［19－21］。研究表明，KTI基因参与多种生物胁迫及非生物胁迫的响应，如抗虫、耐盐碱等。

实验室前期的转录组分析显示，RpKTI基因的表达量在刺槐应答铅镉胁迫过程中出现明显的上调，表明RpKTI基因可能参与了刺槐对铅镉的胁迫应答过程。本研究成功从刺槐中克隆得到RpKTI基因全长序列，其开放阅读框ORF长度为633 bp，共编码210个氨基酸，相对分子量为22 763.87 Da，与决明（26.68548 kDa）、鹰嘴豆（25.7 kDa）、黑豆（23.9 kDa）、蒙古沙冬青（21.5 kDa）等豆科植物的KTI基因分子量大小相近［22－25］，属于STI家族。RpKTI基因编码蛋白的信号肽序列位于整个氨基酸序列的第1～24位；具有跨膜结构和信号肽，属于分泌蛋白；磷酸化主要集中在Ser、Thr、Tyr氨基酸位点。糖基化根据被修饰的类型可分为4类，以N－糖基化类型最多见，一般在Asn－X－Ser／Thr模式序列上出现［26］。RpKTI基因编码蛋白含有磷酸化位点11个，其中Ser位点最多，可能参与蛋白质的磷酸化调控；N－糖基化位点1个，位于第65位Asn氨基酸位点；RpKTI基因编码蛋白的二、三级结构主要以延伸链（32.38%）和无规则卷曲（37.62%）为主，而无规则卷曲影响着蛋白质的空间构象及其功能［27］。RpKTI基因的氨基酸序列与其他豆科植物的同源性为72.64%，可能KTI基因在豆科植物中是一个较为保守的基因。系统进化树发现其与蒺藜苜蓿的亲缘关系更近。

为了进一步了解RpKTI基因的表达水平，通过qRT－PCR分析了RpKTI基因在铅镉胁迫下的表达量，在铅镉混合处理3 d时，叶中的表达量最高，随着胁迫时间的延长，对胁迫的响应呈下降趋势，可能在此状态下，植株已经对铅镉的吸收达到饱和状态，并对铅镉胁迫产生耐性［28］，其具体功能表达还需进一步试验分析。

通过对RpKTI基因的克隆、生物信息学分析及表达分析，为后期RpKTI基因的功能验证、解析其与刺槐铅镉耐受性及其作用机理提供了理论依据。