大蒜根系分泌物对烟蚜的生物活性

吴晓婷，赖荣泉*，顾 钢，米月娥，韩 梦，张 榜，曾文龙

（1.福建农林大学植物保护学院/闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福州 350002；2.中国烟草总公司福建省公司，福州 350003；3.福建省烟草公司龙岩市公司，龙岩 364000）

烟蚜Myzuspersicae(Sulzer)又叫桃蚜，是烟草生产上的一种重要害虫，在我国各大烟区均有发生[1]。烟蚜寄主范围广、繁殖速度快、数量多，可通过吸取烟株汁液直接为害烟株，还可通过分泌蜜露，诱发煤污病和传播多种烟草病毒病间接为害烟株[2]。在烟草生产上，化学防治由于见效快、效果好，因此成为烟农控制烟蚜最常用的手段。但长期不合理利用化学农药防治烟蚜，容易造成农药残留、烟蚜产生抗药性和环境污染严峻等问题[3]。由于粘黄板等物理防治效果不稳定，且成本较高，因此不利于大面积推广[4]。利用天敌烟蚜茧蜂防治烟蚜虽有一定效果，但生产上不能完全仅依靠天敌来防治烟蚜。近年来，人们通过从植物中提取具有较好杀虫活性的物质来防治农林害虫已成为研究的热点，本文旨在开发一个新型杀虫剂。这种杀虫剂对烟蚜的防治具有重要的意义。

近年来，植物根系分泌物在植物病虫害防治中的研究和应用越来越受人们的重视[5]。大蒜Allium sativumL.为百合科葱属植物，种质资源丰富，我国大蒜种植面积占全球栽培面积的三分之二[6]。在农业生产中，大蒜是公认的良好前茬作物，一些作物与大蒜轮作、间作或套种可减轻病虫害的发生[7-10]。郑素慧等[11]发现大蒜精油对印度谷螟Plodiainterterpunctella幼虫的羽化抑制作用显著。谢枫等[12]发现，50%大蒜精油对灰茶尺蠖EctropisgrisescensWarren具有较好的防效。张强等[13]研究表明，大蒜精油对桃蚜Myzuspersicae(Sulzer)有较强的毒杀作用，可有效控制桃蚜。徐向龙[14]曾报道，可利用大蒜与白菜间作来控制蚜虫，减少蚜虫的发生数量。大蒜乙醇抽提物对烟蚜和斜纹夜蛾SpodopteralituraFabricius 3龄幼虫有一定的拒食与毒杀作用、对烟蚜和烟粉虱Bemisiatabaci有较明显的干扰作用[15,16]。虽然烟田套种大蒜烟蚜种群数量显著降低且发生也较迟[10,17]，但其控制机制除了烟-蒜生态系统多样性及大蒜地上部挥发物等对烟蚜有驱避、忌避等作用外[8,18]，大蒜根系分泌物等地下部分对烟蚜是否也有忌避、触杀等作用呢？这方面研究目前未见有报道。

因此，本试验通过收集大蒜根系分泌物、分析鉴定其成份，测定了大蒜根系分泌物粗提物及其4种成份对烟蚜的忌避、触杀等生物活性，鉴定了具有明显效果的驱虫活性物质，进而明确大蒜根系分泌物及其成份对烟蚜的作用，以期为利用大蒜根系分泌物控制烟蚜或研制植物保护剂提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

烟草品种：红花大金元，福建省烟草农业科学研究所南平分所提供。

无翅烟蚜：采自长汀县烟草公司科技园，并在福建农林大学科技园田间实验室内饲养2～3代后试验。

试剂：99.5%邻苯二甲酸二丁酯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；98.0% 2,6-二异丙基苯酚，上海麦克林生化科技有限公司；85.0%二烯丙基二硫，上海麦克林生化科技有限公司；AR，2,6-二叔丁基对甲酚，上海麦克林生化科技有限公司；99.5%丙酮，西陇科学股份有限公司；99.5%甲醇，西陇科学股份有限公司。

仪器材料：Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱仪（GC-MS），美国安捷伦公司；MRC-250B-LED人工气候箱，宁波普朗特仪器有限公司；AUY120电子天平，日本岛津公司；OLYMPUS BX43生物显微镜，福建远明生物科技有限公司；MLS-3781L-PC灭菌锅，日本Panasonic公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；PDE0003微量点滴仪，上海瑾瑜科学仪器有限公司；品氏泥炭基质，丹麦品氏托普公司；塑料瓶（瓶口直径95 mm，瓶底直径80 mm，高85 mm，容积450 mL）等。

1.2 大蒜根系分泌物收集

参考周艳丽等[19]和刘素慧等[20]方法。采用固体琼脂培养法，获得含有大蒜根系分泌物的培养基[21]。

1.3 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的生物活性测定

1.3.1 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的忌避活性测定 参考蒋恩顺等[22]和商显坤等[23]的方法。利用叶片涂抹法，将已浓缩好的大蒜根系分泌物粗提物用50%甲醇水溶液分别稀释为0.25，0.50，1.00，2.00和4.00 g/mL。将新鲜的烟叶沿中间叶脉剪成2半长方形叶碟（长×宽＝4 cm×2 cm），用毛笔刷将1 mL不同浓度的大蒜根系分泌物粗提物均匀地涂抹在一半叶碟正反两面，另一半叶碟用1 mL 50%甲醇水溶液稀释过的不种蒜瓣粗提物混合液涂抹（对照），阴干后，置于保湿烟草叶片的培养皿中。每培养皿中放置1片2半叶碟，每皿中处理和对照各1半烟叶（2半叶碟）。将试验前已饥饿4 h的4龄烟蚜接入培养皿中（2半烟叶中间）。每皿接入30头烟蚜，培养皿用保鲜膜封口，并用针扎50个通气孔，每处理或对照重复3次。放置在25 ℃的温室内，于12、24、48 h后检查各培养皿中烟叶上烟蚜栖息数量。忌避率（%）＝（对照叶片栖息虫数—处理叶片栖息虫数）/（对照叶片栖息虫数＋处理叶片栖息虫数）×100。

1.3.2 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的触杀活性测定 参考蒋恩顺等[22]和张敏等[24]的方法。采用点滴法，大蒜根系分泌物粗提物用50%甲醇水溶液分别稀释为0.25，0.50，1.00，2.00和4.00 g/mL。用微量点滴仪分别在烟蚜的前胸背板处点滴1 μL不同浓度的大蒜根系分泌物粗提物。每处理30头4龄无翅烟蚜，每个处理重复3次，以50%甲醇水溶液稀释过的不种蒜瓣粗提物混合液为对照。处理后将烟蚜接入带有保湿的烟草叶片培养皿中，培养皿用保鲜膜封口，并用针扎50个通气孔。放置在25 ℃的温室内，分别在12、24、48 h后检查烟蚜存活情况。用毛笔刷轻触烟蚜的足和触角，若无反应即为死亡。死亡率（%）＝死亡虫数/（活虫数＋死亡虫数）×100；校正死亡率（%）＝（处理死亡率—对照死亡率）/（1—对照死亡率）×100。

根据公式分别计算其死亡率、校正死亡率。

1.4 大蒜根系分泌物四种成份对烟蚜的生物活性测定

根据本课题组对大蒜根系分泌物成份的分析（吴晓婷等[21]）及周艳丽等[25]和刘素慧等[20]试验，结合本试验初筛结果，选取邻苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和 2,6-二异丙基苯酚 4种大蒜根系分泌物成份进行试验。

1.4.1 大蒜根系分泌物4种成份对烟蚜的忌避活性测定 参考蒋恩顺等[22]和商显坤等[23]方法。用50%丙酮将邻苯二甲酸二丁酯、2,6-二异丙基苯酚、二烯丙基二硫、2,6-二叔丁基对甲酚四种标准化合物按体积比1: 1000，1: 500，1: 100，1: 50，1: 10配置成梯度溶液，以50%丙酮水溶液作为对照。方法同“1.3.1”。根据公式计算其忌避率。

1.4.2 大蒜根系分泌物 4种成份对烟蚜的触杀活性测定 参考蒋恩顺等[22]和张敏等[24]的方法。采用点滴法，用50%丙酮将邻苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和2,6-二异丙基苯酚4种标准化合物按体积比1:1000，1:500，1:100，1:50，1:10配置成梯度溶液，以50%丙酮水溶液作为对照。方法同“1.3.2”，分别计算其死亡率、校正死亡率。

1.5 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2003软件记录、整理数据和作图，SPSS 22.0软件进行方差分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比较（LSD）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的忌避活性

在同一处理时间（12、24、48 h）后，烟蚜的忌避率随着大蒜根系分泌物处理浓度的升高而增大，且差异均达极显著（12 h：F5,12＝29.161，P＝0.000；24 h：F5,12＝52.487，P＝0.000；48 h：F5,12＝37.703，P＝0.000）。大蒜根系分泌物为4 g/mL时，处理12 h、24 h和48 h后，大蒜根系分泌物对烟蚜的忌避率分别为80.56%、79.89%和75.93%，忌避活性较好；当浓度为0.25 g/mL时，大蒜根系分泌物对烟蚜的忌避率分别为8.02%、14.69%和19.17%，忌避活性相对较差。除0.25 g/mL外，同一大蒜根系分泌物浓度下，随着处理时间的延长，大蒜根系分泌物对烟蚜的忌避率总体呈下降趋势（图1）。

图1 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的忌避活性Fig.1 Deterrent activity of garlic root exudates against M.persicae

2.2 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的触杀活性

大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜具有较好的触杀活性，其死亡率在2.22%～96.67%。在同一处理时间（12、24、48 h）后，烟蚜的死亡率随着大蒜根系分泌物浓度增大而增加，当大蒜根系分泌物浓度≥1 g/mL时，其死亡率、校正死亡率与对照相比差异均显著。当浓度为 4 g/mL时，12、24、48 h后烟蚜的死亡率分别为93.33%、92.22%和96.67%，且差异均达极显著（12 h：F5,12＝55.061，P＝0.000；24 h：F5,12＝65.780，P＝0.000；48 h：F5,12＝48.776，P＝0.000）；其校正死亡率分别为93.10%、92.07%和96.47%，差异均达极显著（12 h：F5,12＝54.479，P＝0.000；24 h：F5,12＝70.314，P＝0.000；48 h：F5,12＝44.408，P＝0.000）（图 2）。

图2 大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜的触杀活性Fig.2 Toxic activity of garlic root exudates against M.persicae

2.3 大蒜根系分泌物四种成份对烟蚜的忌避活性

大蒜根系分泌物四种成份，邻苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和2,6-二异丙基苯酚对烟蚜均有不同程度的忌避活性。四种成份处理烟蚜后，发现以 2,6-二异丙基苯酚的忌避活性较好，不同时间段内差异均极显著（12 h：F5,12＝122.623，P＝0.000；24 h：F5,12＝145.594，P＝0.000；48 h：F5,12＝92.136，P＝0.000），除 12 h 1:1000的处理对烟蚜有吸引作用外，其他处理对烟蚜的忌避率在24.84%～100.00%，忌避活性随2,6-二异丙基苯酚浓度的增加而增大。其中，浓度为1:50和1:10的2,6-二异丙基苯酚对烟蚜的忌避活性较好，其对烟蚜的忌避率为 93.65%～100.00%，而 1:10浓度处理下，烟叶皱缩腐烂，引起药害。其次依次为二烯丙基二硫、邻苯二甲酸二丁酯，其忌避率分别为 20.31%～100.00%和 6.73%～85.47%。2,6-二叔丁基对甲酚的忌避活性较差，忌避率为7.23%～53.41%，处理12、24、48 h后差异均极显著（12 h：F5,12＝7.291，P＝0.001；24 h：F5,12＝6.174，P＝0.005；48 h：F5,12＝5.774，P＝0.000）。在同一浓度不同处理时间下，除邻苯二甲酸二丁酯对烟蚜的忌避率呈下降趋势外，其他三种成份总体呈上升趋势。总体上，这4种大蒜根系分泌物成份对烟蚜的忌避活性由强至弱顺序为2,6-二异丙基苯酚，二烯丙基二硫，邻苯二甲酸二丁酯，2,6-二叔丁基对甲酚（表1）。

表1 大蒜根系分泌物四种成份对烟蚜的忌避活性Table 1 Deterrent activity of the four components of garlic root exudates against M.persicae

2.4 大蒜根系分泌物四种成份对烟蚜的触杀活性

大蒜根系分泌物四种成份，邻苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和 2,6-二异丙基苯酚对烟蚜均有不同程度的触杀活性，其持续活性较好。四种成份对烟蚜的触杀活性均达显著差异。在同一时间不同浓度处理下，死亡率均随物质浓度增加而增大，在同一浓度不同时间内，烟蚜的死亡率随着时间增加而逐渐增大。对烟蚜具有较好触杀活性的是邻苯二甲酸二丁酯和 2,6-二异丙基苯酚，二者浓度≥1:100，处理48 h后，发现烟蚜的死亡率均在83.33%～92.22%，且差异达极显著（P＝0.000），其校正死亡率也在79.48%～90.61%，差异极显著（P＝0.000）。其次为2,6-二叔丁基对甲酚和二烯丙基二硫，二者在浓度≥1:100，处理烟蚜48 h后，其死亡率均在47.78%～90.00%，与对照差异达极显著（P＝0.000），其校正死亡率均在36.63%～88.43%，差异极显著（P＝0.000）。总体上，这4种大蒜根系分泌物成份对烟蚜的触杀活性由强至弱顺序为2,6-二异丙基苯酚，邻苯二甲酸二丁酯，2,6-二叔丁基对甲酚，二烯丙基二硫（表2）。

表2 大蒜根系分泌物四种成份对烟蚜的触杀活性Table 2 Toxic activity of the four components of garlic root exudates against M.persicae

3 讨论

本试验结果表明大蒜根系分泌物及其4种成份均对烟蚜有显著的触杀或忌避活性。其中，当大蒜根系分泌物粗提物为4 g/mL时，粗提物对烟蚜有较好的忌避活性、触杀活性。这与赖荣泉和尤民生[16]报道的结果相一致。姬静华等[26]发现大蒜植株和蒜瓣中的大蒜素对福寿螺具有抑制取食为害，甚至毒杀的效果。赖荣泉和尤民生[16]报道了大蒜乙醇抽提物对烟蚜拒食活性和触杀活性有显著的作用，大蒜地上部分茎叶或地下部蒜瓣等提取物均对烟蚜或其他虫害有一定的拒食活性和触杀作用。本文试验结果也说明大蒜地下部分即根系分泌物对烟蚜有明显的忌避、触杀作用。

经对大蒜根系分泌物分离、成份鉴定（吴晓婷等[21]）及测定其4种成份对烟蚜的生物活性发现：大蒜根系分泌物4种成份对烟蚜也有显著的忌避和触杀作用。其中，2,6-二异丙基苯酚对烟蚜的忌避活性较好；邻苯二甲酸二丁酯和2,6-二异丙基苯酚对烟蚜触杀活性较好。董志坚等[27]也报道大蒜精油对烟蚜有较好的毒杀活性。这说明大蒜根系分泌物中某些成份对烟蚜具有较高的忌避、触杀作用，也说明大蒜根系分泌物主要成份与地上部分提取物、大蒜精油相似均对烟蚜有明显的忌避、触杀作用，但它们起作用的物质或成份是否相似，有待进一步的研究。

此外，我们发现大蒜根系分泌物4种成份中以2,6-二异丙基苯酚对烟蚜的忌避活性和触杀活性最强，但关于其生理生化机制，有待进一步的研究。另外，试验中发现2,6-二异丙基苯酚在1: 10浓度下，烟叶皱缩腐烂，引起药害，而 1:100浓度下，2,6-二异丙基苯酚可明显提高对烟蚜的忌避率和死亡率。因此，本文研究结果可为研制含大蒜根系分泌物或其成份的植物保护剂和间作、套种大蒜等绿色防控措施防控烟蚜提供科学参考。