体外胰腺腺泡细胞炎性反应中ZFP580与内质网应激的相互作用

资 力，刘广林，张文成，夏时海，许 威

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常见的消化道急症和重症，发病机制主要包括消化酶的过早激活、炎性反应和腺泡细胞死亡。尽管既往相关研究已经很多，但AP过程中腺泡细胞损伤的分子机制仍未完全阐明。内质网应激(ER-stress，ERS)是一种以内质网中未折叠和错误折叠蛋白的积累为特征的细胞功能障碍状态。胰腺腺泡细胞作为消化酶的主要合成来源，其内质网非常丰富，使得腺泡细胞易受到AP过程中各种炎性反应因子的诱导，从而发生ERS。严重和持久的ERS会导致细胞内活性氧增加，线粒体释放更多的细胞色素C，并且诱导Caspase12介导的细胞凋亡并促进NF-κB介导的炎性反应，干扰体内钙调节通道，进而引起不可逆的细胞损伤。锌指蛋白580(zinc finger protein 580，ZFP580)是由张文成教授克隆出的一种新发现的DNA结合蛋白，前期研究结果表明ZFP580与胰腺纤维化、胰腺慢性炎性反应发生发展过程及IL-6、ROS、NF-κB等炎性因子之间有密切关联，检索GEO数据库显示人乳腺癌细胞系中ZFP580表达与未折叠蛋白反应下游效应因子Xbp-1s的表达呈现一定相关性，BGEE数据库显示经基因测序ZFP580在鼠胰腺组织有表达。本研究以探索胰腺腺泡细胞炎性反应过程中，ZFP580与ERS相互作用的具体途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠AR42J购于美国典型培养物保藏中心，由武警特色医学中心消化疾病研究所保种。RPMI1640培养液(美国Hyclone)；青链霉素混合液(北京索莱宝)；胎牛血清FBS(美国Gibico)；DMSO(美国Sigma)；IRE1阻断剂MKC-3946(美国Sigma)；6/12/24/96孔板(美国Thermo Fisher)；β-actin抗体(德国罗氏)；山羊抗兔荧光二抗(武汉Proteintech)；XBP-1s抗体(美国Abcam)；Chop抗体(沈阳万类生物科技)；Caspase-3抗体(沈阳万类生物科技)；ZFP580抗体(美国Abcam)；转膜槽(美国Bio-Rad)；电泳仪(美国Bio-Rad)；7500实时荧光定量PCR仪(美国Appllied Biosystems)；细胞培养箱(美国Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取出存放的AR42J细胞，解冻后加入培养液，在设置好的孵育箱中培养，定期更换培养液。待观察皿内细胞生长至基本饱和(密度90%以上)时，传代以使细胞继续生长。

1.2.2 细胞干预与分组 依照实验需求，IRE1阻断剂(MKC-3946)、慢病毒，蛙皮素在IRE1阻断剂作用1 h后加入，根据处理方式分为普通对照组、单阻断剂组、单蛙皮素刺激组、慢病毒转染组、阻断剂+蛙皮素刺激组及转染+蛙皮素刺激组。

1.2.3 MTT法检测蛙皮素作用时间对AR42J细胞活性影响 取AR42J细胞制成细胞悬液，按要求接种在96孔板内，保留空白对照，余分别在0、4、8、12、16、20 h加入蛙皮素(终浓度为100 nM)，分别设置3个复孔，培养24 h后加入10 μl MTT，继续培养4 h后每孔换成150 μl的二甲基亚砜，震荡10 min后测定各孔的吸光值，根据结果计算IC。

1.2.4 RT-PCR检测ZFP580 mRNA的表达 收取6孔板中AR42J细胞提取RNA并平衡浓度，反转录cDNA后检测目的mRNA水平。

1.2.5 细胞总蛋白提取及Western-blot检测 收取AR42J细胞，加入RIPA蛋白裂解液，离心，取上清液。BCA法测定各组蛋白浓度，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，蛋白经电泳分离后转至PVDF膜，经5%脱脂牛奶封闭后，分别加入β-actin、ZFP580、Xbp-1s、Caspase-3、Chop单克隆抗体作为一抗，4 ℃过夜，经TBST缓冲液洗涤后加入HRP标记山羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育2 h，经TBST缓冲液洗涤后，应用ECL发光法显影，采用Image J图像分析系统进行分析。

1.2.6 慢病毒沉默ZFP580 取生长状态良好的AR42J细胞按要求接种在6孔板内。于各组加入4E+6TU的慢病毒lv-zfp580-RNAi (73469-1)、CON313以及4 μl的病毒感染试剂HitransG转染细胞。转染完成后分别于各组加入2 μg /ml嘌呤霉素进行筛选(重复进行此步骤5次，以期转染率达95%以上)。

1.2.7 Hochest33342染色检测细胞凋亡情况 细胞处理后，加入Hochest固定液10 min，PBS冲洗2次，加入Hochest染色液0.5 ml孵育5 min，吸尽染色液后洗涤2次，而后封片置于荧光显微镜下观察。

2 结 果

2.1 AR42J细胞炎性反应过程中ERS启动 蛙皮素能诱导AR42J细胞炎性反应过程，以100 nM 蛙皮素刺激后提取RNA进行RT-PCR检测以观察炎性反应过程中ERS相关标志物的表达情况。结果显示，与对照组比较，ER-Stress标志物GRP78和效应因子XBP-1s从4 h开始升高，ZFP580由8 h开始升高，差异有统计学意义(<0.05，表1)，上述因子表达随时间延长而逐渐增加。

2.2 蛙皮素作用时间对AR42J细胞活性影响 Cer造模时一般采用100 nM浓度，作用时间12～24 h。Cer对AR42J细胞活性的抑制呈时间依赖，为后续观察细胞凋亡坏死结果，取细胞死亡一半的作用时间作为后续实验的Cer干预时间，计算IC=19；即Cer浓度100 nM、作用19 h达到一个合适的平衡，得到实验所需造模效果(图1)。

2.3 应用IRE1抑制剂(MKC-3946)后ZFP580表达情况 对GEO数据库芯片数据进行检索后推测ZFP580可能位于UPR信号途径之一的IRE1通路。使用IREI抑制剂(MKC-3946)抑制IRE1通路表达，RT-PCR结果显示，与对照组相比，抑制剂组的ZFP580的表达受抑制；WB结果(图2)与PCR结果类似，差异有统计学意义(<0.05，表2)，由此推测ZFP580与UPR反应相关联，且位于IRE1下游。

2.4 慢病毒转染AR42J细胞 以慢病毒转染沉默ZFP580得到低表达AR42J细胞株。转染后RT-PCR和WB(图3)验证，沉默组ZFP580表达明显下降，提示转染成功(<0.05，表3)。

2.5 沉默ZFP580对IRE1通路影响 为进一步明确ZFP580在IRE1通路中的位置，以Cer刺激AR42J造模，结果显示：与对照组相比，低表达组XBP-1s的表达明显降低，差异有统计学意义(<0.05，表4)。

2.6 沉默ZFP580对细胞凋亡-坏死的影响 以AR42J细胞经Cer干预后，使用Hochest染色观察细胞形态变化，从形态学结果观察发现低表达组的坏死细胞比例要明显高于普通AP组(图4)。同时，WB法检测相关凋亡蛋白Chop/Caspase-3的表达情况，结果显示Cer刺激19 h后Chop的表达量，沉默ZFP580组要明显高于普通AP组，而沉默ZFP580组中Caspase-3的表达要低于普通AP组(图5)。证明沉默ZFP580后，AP过程中坏死比例增高，而Caspase-3与细胞凋亡相关，其表达下降证实凋亡比例相应降低。

3 讨 论

ERS启动后发生的未折叠蛋白反应(UPR)包含3条不同的信号途径，分别是IRE1、ATF6和PERK。细胞受到炎性反应因子的诱导时，IRE1通路启动，产生活性转录因子XBP-1s，诱导内质网中有关于蛋白质折叠和降解的基因转录。针对沉默XBP-1动物模型的研究揭示了XBP-1在胰腺外分泌中的重要作用，缺乏XBP-1的小鼠表现出严重的胰腺外分泌功能不全，出生后不久即因消化功能不全、营养不良导致死亡。有研究显示，与野生小鼠相比，沉默XBP-1小鼠ERS标志物GRP78/BIP以及UPR反应通路蛋白ATF6和PERK明显升高，同时对腺泡细胞分化标记物检测发现，其淀粉酶和弹性酶水平相较于野生小鼠降低了60%～70%。因此，IRE1/XBP-1这一信号通路对于胰腺腺泡细胞内环境稳定以及损伤后的恢复非常重要。本研究发现，在Cer刺激的AR42J中，沉默ZFP580可降低XBP-1s的表达，并影响凋亡因子Caspase-3的反应水平，这提示了ZFP580可能通过调节腺泡细胞的凋亡水平来影响AP炎性反应的程度。

Rasheva等发现，GRP78/BIP水平的变化可预示细胞是否进入ERS状态。由此猜测，ERS在胰腺炎初期即开始发挥作用。UPR反应重要的转录因子XBP-1s可调控ERS伴侣分子表达，在我们的实验中发现AR42J细胞发生ERS后ZFP580的表达出现显著升高，ERS标志物GRP78和通路IRE1下游产物XBP-1s和凋亡相关因子Chop、Caspase-3的表达相继增加，使用慢病毒下调ZFP580表达后，从PCR及WB结果发现下游产物XBP-1s降低，而凋亡相关因子Caspase-3的表达也随之下降。由此我们推测ZFP580在由蛙皮素诱导胰腺腺泡细胞引起的ERS中发挥了重要作用，且XBP-1s可能是ZFP580在ERS途径中的一个作用靶点。

在AP进展过程中，胰腺腺泡细胞损伤是一个多因素介导的复杂生物学过程，最终导致细胞凋亡或坏死。腺泡细胞死亡是胰腺炎结局的一个重要影响指标。细胞凋亡和坏死是程序性死亡的不同形式，在维持哺乳动物内环境稳定方面扮演重要角色。细胞的凋亡和坏死与AP炎性反应的严重程度密切相关。目前随着研究的深入，胰腺腺泡细胞损伤的新机制不断被阐明。长期激活的ERS会导致腺泡细胞产生凋亡反应。Caspase活化已知有4种途径:死亡受体途径、线粒体途径、颗粒酶B介导途径和内质网介导途径。大量研究发现，ERS后期通过调节细胞凋亡和坏死来加重胰腺腺泡细胞的炎性反应损伤，从而加速胰腺炎的病理过程。Chen等通过观察急性水肿型和重型坏死性胰腺炎模型大鼠胰腺腺泡细胞死亡时发现，前者较后者凋亡指数高，坏死比例小。除了对腺泡细胞的研究，Fonseca等发现ERS会影响胰岛β细胞的功能甚至导致其死亡。ERS诱导的细胞凋亡可通过多种信号途径实现，其中诱导细胞凋亡，而不是坏死或线粒体靶向性凋亡。而激活的XBP-1s可使JNK磷酸化，激活下游转录因子(如c-jun, c-fos和 Sap-1)并调节胞内RNA稳定性，影响细胞凋亡。

本研究通过Hochest染色发现，与对照AP组相比，沉默ZFP580组的坏死细胞比例明显升高，这在WB结果(Chop表达量增加)中得到证实，同时Caspase-3的表达水平降低，证实凋亡比例下降。因此我们推测，体外实验中ZFP580可能通过改善腺泡细胞炎性反应过程中的凋亡坏死比例，来实现其在AP进程中的保护作用。

总之，本研究通过体外研究发现胰腺腺泡细胞通过ERS诱导了ZFP580表达，进而在促进腺泡细胞的凋亡同时减少坏死，进而减轻AP的严重程度，值得进一步研究。