补骨脂乙醇提取物活性成分与抗氧化及胆酸盐结合能力的关联性分析

姜欣洋，梁金月，史继童，刘兰玲，张珊珊，赵 盼，颜培正，赵东升,

（1.山东中医药大学药学院，山东济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东济南 250355）

补骨脂（Psoralea corylifoliaL.）是一种豆科补骨脂属草本植物，主产于云南西双版纳和四川金沙江流域[1−3]，被广泛应用于保健食品领域，如其乙醇提取物已作为食品添加剂用于泡菜等食品的加工生产[4−6]。其种子或果实具有重要的药理活性，中医临床常用其治疗由肾阳不足引起的阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝酸痛等疾病[7]。文献调研表明其具有抗氧化、降胆固醇、抗炎和免疫调节等生理活性[2,8]，这主要与其所含有的黄酮类、单萜酚类、酚类苯桂酸等成分有关[6,9]。不同极性溶剂可以显著地影响植物提取物的主要化学成分含量和功效[10−11]，目前，国内外有对补骨脂总黄酮提取方法及提取工艺和补骨脂不同浓度乙醇提取物干预小鼠前列腺增生作用差异的研究[12−14]，并有研究报道补骨脂乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[15]，但鲜有补骨脂不同浓度乙醇提取物中的主要活性成分含量及其体外抗氧化与降脂功效的比较研究。

中药成分复杂多样，通过将成分含量与生物活性进行关联分析，可以初步筛选活性组分和评价质量[16−17]。因此，本实验在“成分-功效”关联模式下，采用不同浓度乙醇分别提取补骨脂，进行总黄酮与总多酚含量比较，利用ABTS+·清除率、DPPH·清除率、还原能力和胆酸盐结合率体外实验开展抗氧化和降血脂能力评估，通过相关性分析建立补骨脂不同浓度乙醇提取物主要活性成分-体外抗氧化/降脂功效的评价模型，旨在为补骨脂在保健食品、药物等应用领域的进一步研究和资源利用提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

补骨脂（四川）安徽亳州中药材批发市场，经山东中医药大学张永清教授鉴定为豆科补骨脂属植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实；2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）纯度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；铁氰化钾 纯度≥99.5%，天津市巴斯夫化工有限公司；胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠盐 纯度≥98%，上海凯为化学科技有限公司；芦丁 纯度大于98%，上海源叶生物科技有限公司；没食子酸、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、三氯化铁、三氯乙酸、无水乙醇 均为国产分析纯。

KQ-500GVDV 双频恒温数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；X-5 紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司；RH-QG 全温光照振荡器常州市金坛精工仪器设备有限公司；FA1204B 电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司；ST16R 高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 补骨脂不同浓度乙醇提取物制备 将补骨脂自然晾干，粉碎，过60 目筛。准确称取补骨脂粉末4 份，每份40 g，分别置于锥形瓶中，按1:40 g/mL 料液比分别加入无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇和水，参考鲁宪坤等[13]的方法进行提取，抽滤，滤液浓缩至浸膏状，分别用相应溶剂溶解定容至100 mL，即得提取物溶液（相当于原药材0.4 g/mL）。

1.2.2 总黄酮、总多酚含量测定 分别取无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液0.1 mL 置于10 mL容量瓶中，参考裴文清等[18]的方法测定。配制质量浓度为0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL 的芦丁标准溶液，绘制标准曲线，得回归方程为：A=12.416C+0.0092，r=0.9990（A 为吸光度值；C 为芦丁质量浓度：mg/mL）。结果以每克补骨脂粉末中所含芦丁当量（mg/g）表示。

分别移取无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液0.1 mL 置于10 mL容量瓶中，参考崔施展等[19]的方法测定。配制质量浓度为0、0.001、0.003、0.005、0.007、0.009 mg/mL 的没食子酸标准溶液，绘制标准曲线，得回归方程为：A=96.11C+0.0203，r=0.9991（A 为吸光度值；C 为没食子酸质量浓度：mg/mL）。结果以每克补骨脂粉末中所含没食子酸当量（mg/g）表示。

1.2.3 不同浓度乙醇提取物的抗氧化活性测定

1.2.3.1 ABTS+·清除能力测定 分别移取浓度为2、4、6、8、10 mg/mL 无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液0.5 mL 于10 mL 的离心管中，参考杨美莲等[20]的方法测定。按式（1）计算清除率。

式中：A0为0.5 mL 乙醇溶液代替样品溶液的吸光度值；A1为样品组吸光度值；A2为4 mL 无水乙醇代替ABTS 溶液的吸光度值。

1.2.3.2 DPPH·清除能力测定 分别移取浓度为2、4、6、8、10 mg/mL 无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液2 mL 于10 mL 的离心管中，参考慕钰文等[21]的方法测定。按式（2）计算清除率。

式中：A0为2 mL DPPH 溶液加入2 mL 乙醇溶液的吸光度；A1为2 mL 样品溶液加入2 mL DPPH溶液的吸光度；A2为2 mL 样品溶液加入2 mL 无水乙醇的吸光度。

1.2.3.3 还原能力的测定 分别移取浓度为2、4、6、8、10 mg/mL 无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水提取液和VC溶液0.5 mL 于10 mL 的离心管中，参照黎善铭等[22]的方法测定。吸光度值越高，表明其还原能力越强。

1.2.4 结合胆酸盐实验 分别移取质量浓度为2、4、6、8、10 mg/mL 四种提取液0.5 mL 于3 支50 mL离心管中，各加入4 mL 的胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠溶液（0.6 mmol/L），参考李珊等[23]的方法测定。按式（3）计算结合率。

式中：A0为0.5 mL 对应溶剂加入4 mL 胆酸盐的吸光度；A1为0.5 mL 样品溶液加入4 mL 胆酸盐溶液的吸光度；A2为0.5 mL 样品溶液加入4 mL 磷酸缓冲液的吸光度。

1.3 数据处理

以上实验均平行操作三次，数据以 X¯±SD 表示。采用SPSS 26.0，GraphPad Prism 8.0.1 进行数据处理和绘图，使用Pearson 相关性分析。

2 结果与分析

2.1 补骨脂不同浓度乙醇提取物中总黄酮和总多酚含量分析

由表1 可知，补骨脂不同溶剂提取物中总黄酮和总多酚含量存在显著性差异（P＜0.05），总黄酮和总多酚含量随着溶剂极性的增大而降低，与慕钰文等[21]研究花椒籽不同浓度乙醇提取物中总多酚含量变化规律相似，根据相似相溶原理推测此变化趋势是由于补骨脂中黄酮和多酚多属于低极性物质所致。总黄酮含量范围为（5.980±0.023）～（50.317±0.018）mg/g，其中，无水乙醇提取物中总黄酮含量最高，达到（50.317±0.018）mg/g，其次是75%乙醇提取物和50%乙醇提取物，水提取物总黄酮含量最少，四者之间差异性显著（P＜0.05），与李婧雯等[24]研究的蒲公英根不同溶剂提取物黄酮含量变化规律相似；总多酚含量范围为（3.860±0.045）～（1.877±0.003）mg/g，无水乙醇和75%乙醇提取物中总多酚含量相近，分别为（3.860±0.045）和（3.670±0.007）mg/g，显著高于50%乙醇提取物和水提取物（P＜0.05）。

表1 补骨脂不同浓度乙醇提取物中总黄酮和总多酚含量Table 1 Contents of total flavonoids and polyphenols of different ethanol extracts from Psoralea corylifolia L.

2.2 补骨脂不同浓度乙醇提取物抗氧化活性分析

2.2.1 补骨脂不同浓度乙醇提取物对ABTS+·清除作用的比较 由图1-A 可以看出，补骨脂不同浓度乙醇提取物对ABTS+·均具有一定的清除能力，当样品溶液浓度在2～8 mg/mL 时，各提取物对ABTS+·清除率随浓度的增大而增大，在8～10 mg/mL 范围内，清除率达到平稳状态。当质量浓度为10 mg/mL 时，各提取物清除率均达到97%左右，但小于VC对照组。由图1-B 可知，各提取物清除ABTS+·的IC50值均大于VC对照组，50%乙醇提取物清除ABTS+·的IC50值为0.76 mg/mL，显著低于其他三种溶剂的IC50值（P＜0.05），其次是无水乙醇、水、75%乙醇提取物，其IC50值分别为2.68、2.94、3.11 mg/mL，因此，50%乙醇提取物清除ABTS+·能力最强，经分析可能是由于50%乙醇提取物存在多糖等其他活性成分，导致其总活性成分含量较高更易于清除ABTS+·，这与师聪等[25]的实验结果一致，即50%乙醇草果提取物清除ABTS+·能力最强。

图1 不同浓度乙醇提取物清除ABTS+·能力（A）及其IC50（B）Fig.1 ABTS cationic radical scavenging abilities (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.2.2 补骨脂不同浓度乙醇提取物对DPPH·清除作用的比较 由图2-A 可知，提取物的DPPH·清除率均小于VC对照组且相互之间差异性显著（P＜0.05），在浓度为2～8 mg/mL 范围内，各提取物对DPPH·清除率随着浓度的增大具有上升趋势，在8～10 mg/mL范围内，清除率增加缓慢。当浓度为10 mg/mL 时，无水乙醇和50%乙醇提取物对DPPH·清除率分别达到93.21%和92.64%，其次为75%乙醇和水提取物，清除率分别达到87.37%和79.15%。由图2-B可知，各提取物清除DPPH·的IC50值均大于VC对照组，无水乙醇和50%乙醇提取物清除DPPH·的IC50值最小，分别是1.89 和1.63 mg/mL，其次是75%乙醇和水提取物，IC50值分别为3.58 和3.89 mg/mL，因此，50%乙醇提取物对DPPH·清除能力最强，这与覆盆子50%乙醇提取物清除DPPH·能力最强报道结果一致[26]，此结果可能是由于除黄酮多酚外，其他活性物质也参与抗氧化体系所导致。

图2 不同浓度乙醇提取物清除DPPH·能力（A）及其IC50（B）Fig.2 DPPH free radical scavenging abilities (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.2.3 补骨脂不同浓度乙醇提取物还原能力的比较由图3-A 可知，VC的还原能力最大，VC浓度为2～10 mg/mL 时，还原能力基本维持在3.5 以上。在浓度为2～10 mg/mL 时，各提取物的还原能力随提取物浓度的增加而升高。当样品浓度为10 mg/mL 时，无水乙醇、75%乙醇和50%乙醇提取物的还原力分别为0.84、0.82、0.65，而水提取物还原能力较弱，还原力基本维持在0.1～0.25 之间。由图3-B 可知，各提取物还原力为0.5 时对应的提取物质量浓度（A0.5）均大于VC对照组，不同浓度乙醇提取物还原能力的A0.5值大小顺序为：水＞50%乙醇＞75%乙醇＞无水乙醇，这表明无水乙醇提取物还原能力最好，A0.5值为2.63 mg/mL，显著低于其他三种溶剂提取物的A0.5（P＜0.05），这与李春爱等[27]对橄榄果渣还原能力的研究结果相似，即随着提取物乙醇浓度增大还原能力逐渐增大，这可能是由于乙醇含量较多的提取物中总黄酮和总多酚含量较多导致其还原能力较强。

图3 不同浓度乙醇提取物还原能力（A）及其A0.5（B）Fig.3 Reducing capacity (A) and their A0.5 values (B) of different ethanol extracts

2.3 补骨脂不同浓度乙醇提取物对胆酸盐结合能力比较

胆酸盐可以通过“肝肠循环”进行再利用，通过结合胆酸盐，胆酸盐无法完成“肝肠循环”，肝脏将更多的胆固醇转化成胆汁酸，因而间接地降低胆固醇，进而达到降脂目的[28−29]。胆酸盐可分为游离型胆酸盐和结合型胆酸盐[30]，本实验选择游离型胆酸盐（胆酸钠）和结合型胆酸盐（牛磺胆酸钠，甘胺胆酸钠）开展研究。

如图4-A 所示，各提取物对胆酸钠都具有一定的结合能力，结合率随着样品浓度的增加而升高，当样品浓度达到10 mg/mL 时，无水乙醇提取物对胆酸钠的结合能力较大，结合率达到73.14%，其次为水、50%乙醇和75%乙醇提取物，结合率分别为61.98%、58.30%和46.09%。由图4-B 可以看出，无水乙醇、75%乙醇和50%乙醇、水提取物对胆酸钠的IC50值分别为3.63、20.42、6.98 和0.67 mg/mL，所以水提取物对胆酸钠的结合能力最强，其次为无水乙醇提取物、50%乙醇提取物和75%乙醇提取物，并且四种溶剂胆酸钠结合能力存在显著性差异（P＜0.05），可能与水提取物中多糖成分含量较高更易与游离胆酸盐结合有关，这与林沛纯等[31]的研究结果相似，即岩藻聚糖粗多糖对三种胆酸盐中的水合胆酸钠结合能力最大。

图4 不同浓度乙醇提取物结合胆酸钠能力（A）及其IC50（B）Fig.4 Sodium cholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

从图5-A 可以看出，各提取物对牛磺胆酸钠均有一定的结合能力，并且在2～10 mg/mL 浓度范围内，随实验浓度提高结合率逐步增大。当浓度为10 mg/mL时，50%乙醇提取物对牛磺胆酸钠的结合率达到79.56%，并高于10 mg/mL 裙带菜多糖对牛磺胆酸盐的结合率（52.3%）[32]。由图5-B 可知，不同溶剂提取物结合牛磺胆酸钠的IC50值大小顺序：水提取物＞无水乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞50%乙醇提取物，表明50%乙醇提取物对牛璜胆酸钠的结合能力最强，IC50值为1.26 mg/mL，显著低于水提取物的IC50值为4.36 mg/mL（P＜0.05），但其余两种提取物之间差异并不显著（P＞0.05）。经分析可能是由于50%乙醇提取物中除总黄酮和总多酚外，还有多糖等其他活性成分也参与了牛磺胆酸钠的结合体系[29,33]。

图5 不同浓度乙醇提取物结合牛璜胆酸钠能力（A）及其IC50（B）Fig.5 Sodium taurocholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

由图6-A 可以看出，各提取物对甘胺胆酸钠均有一定结合能力，并且在2～10 mg/mL 浓度范围内，随实验浓度提高结合率逐步增大。当浓度为10 mg/mL时，50%乙醇提取物对甘胺胆酸钠的结合能力最强，结合率达到70.97%，与体积浓度为1.0 mL/mL 的药桑葡萄酒对甘胺胆酸钠结合率69.36%结果相近[34]。由图6-B 可以看出，50%乙醇提取物和无水乙醇提取物对甘胺胆酸钠的IC50值较小，分别为0.41 mg/mL和2.07 mg/mL，显著低于其他两种溶剂（P＜0.05），所以50%乙醇提取物对甘胺胆酸钠结合能力最强，其次是无水乙醇提取物，其余两种提取物结合能力相对较弱。

图6 不同浓度乙醇提取物结合甘胺胆酸钠能力（A）及其IC50（B）Fig.6 Sodium glycocholate binding capacity (A) and their IC50 values (B) of different ethanol extracts

2.4 补骨脂不同浓度乙醇提取物中活性成分与抗氧化及胆酸盐结合能力的相关性分析

测定不同浓度乙醇提取物中总黄酮和总多酚含量，通过相关性分析探究活性成分含量与抗氧化及胆酸盐结合能力的关联性，初步建立补骨脂不同浓度乙醇提取物主要活性成分-体外抗氧化/降脂功效评价模型。从表2 可以看出，总黄酮含量与DPPH·清除率、牛磺胆酸钠结合率呈显著性正相关（P＜0.05）；总黄酮、总多酚含量与还原能力均呈极显著正相关（P＜0.01），与张天凤等[35]的研究报道亚麻籽粕提取物总黄酮、总多酚含量与还原能力均呈显著性正相关结果一致；总多酚含量与胆酸钠结合率呈显著性负相关（P＜0.05）；ABTS+·清除率和甘胺胆酸钠结合率与总黄酮和总多酚含量相关性较低。上述结果表明，补骨脂中总黄酮和总多酚均有一定的抗氧化和降脂活性，总黄酮的抗氧化和结合胆酸盐能力更强。

表2 补骨脂活性成分含量与抗氧化活性和胆酸盐结合率的相关性分析Table 2 Correlation analysis between the contents of active components and antioxidant activity and cholate binding rate of Psoralea corylifolia L.

3 结论

本研究选用不同浓度乙醇溶剂提取补骨脂，其主要活性成分含量、体外抗氧化活性及胆酸盐结合能力之间差异显著（P＜0.05）。实验结果表明，补骨脂不同乙醇浓度提取物的总黄酮和总多酚含量范围分别为（5.980±0.023）～（50.317±0.018）mg/g 和（1.877±0.003）～（3.860±0.045）mg/g，其中，无水乙醇提取物总黄酮和总多酚含量均最高。50%乙醇提取物具有最强的ABTS+·和DPPH·清除能力，其次是无水乙醇提取物，而无水乙醇提取物还原能力最强。补骨脂水提取物对胆酸钠的结合能力最强，50%乙醇提取物对牛磺胆酸钠和甘胺胆酸钠的结合能力最强。相关性分析表明，补骨脂不同浓度乙醇提取物中总黄酮含量与DPPH·清除率、牛磺胆酸钠结合率呈显著正相关性（P＜0.05），总黄酮、总多酚含量与还原能力均呈极显著性正相关关系（P＜0.01），总多酚含量与胆酸钠结合率呈显著性负相关（P＜0.05），总黄酮和总多酚含量与ABTS+·清除率和甘胺胆酸钠结合率相关性较低。同时，推测补骨脂中除黄酮和多酚外，多糖等其他重要活性成分也具有良好的抗氧化及降脂活性，需要进一步测定补骨脂中其他活性成分含量并进行分析，为补骨脂作为抗氧化和降脂物质提供一定的指导作用。