微波辅助提取辣木叶总黄酮工艺优化及其抑菌和抗氧化活性研究

杨丽华 董晓倩 董啟露 李晓娇

(保山学院资源环境学院，云南 保山 678000)

辣木(MornigaoleiferaLam.)为辣木科辣木属的一种乔木，因其根有辛辣味而得名，辣木的根、叶和嫩果可以食用，种子含油，可作为润滑油和定香剂[1]。辣木原产印度，近年来在中国云南、广西、广东、海南等地区均有引种[2]。辣木叶中富含多种营养成分和多种活性成分[2-5]，具有降血糖、抗氧化、抗癌、消炎抑菌、降血压和降胆固醇等作用[5-9]，于2012年被批准为新资源食品。目前，已从辣木黄酮类中分离鉴定出芦丁、多花蔷薇苷、牡荆素、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二酰基己糖苷、异鼠李素、芹菜素、表儿茶素等多种黄酮类化合物，这些物质多以苷类形式存在[8-11]。

目前，应用于辣木总黄酮提取的方法有溶剂浸提法[12]、超声波辅助提取法[12-17]、微波辅助提取法[18]、酶解提取法[19]、亚临界流体萃取法[20]和常压内部沸腾法[21]等，其中以溶剂浸提和超声波辅助提取的报道较多。张善添等[12]采用加热回流水提、加热回流水提醇沉、70%乙醇加热回流提取、超声加热水提、超声加热醇提、超声醇提等方法提取辣木叶中的总黄酮，得率分别为1.57%，1.82%，3.25%，1.91%，3.21%，2.64%；吉莉莉等[18]用乙醇浸提和微波辅助法提取辣木叶总黄酮，得率分别为2.60%，3.45%；张展适等[22]利用超声波辅助法的得率仅为0.84%；上述提取率较低，且关于辣木叶总黄酮抑菌活性的报道较少。王远[10]研究表明，辣木叶总黄酮的抑菌效果为大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌；马金魁等[14]研究表明，辣木叶总黄酮的抑菌效果为白色假丝酵母>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌；王丽虹等[23]研究表明，辣木叶总黄酮对枯草芽孢杆菌的抑制作用强于金黄色葡萄球菌，对大肠杆菌则无抑制作用；以上试验结果差异较大。

微波产生的高频电磁波可以加速细胞破裂，促进细胞内黄酮类物质的流出，所以微波辅助提取能缩短提取时间、提高提取效率、减少溶剂消耗，并减少活性物质结构的破坏[24-25]。研究拟利用响应面法优化微波辅助提取工艺，采用滤纸片法测定辣木叶总黄酮对3种供试菌种的抑菌能力，并考察其体外抗氧化活性，旨在为辣木叶总黄酮的高效提取及进一步研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木叶：2020年8月采摘于保山市潞江坝，经保山学院汪建云教授鉴定为辣木科辣木属植物辣木(MornigaoleiferaLam.)；

大肠杆菌(Echerichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)：保山学院微生物实验室；

芦丁标准品：德国Dr. Ehrenstofer Gmbh公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；

牛肉膏：广东环凯微生物有限公司；

蛋白胨：北京奥博星生物科技有限责任公司。

1.2 仪器和设备

高速万能粉碎机：DFY-800型，杭州旭朗机械设备有限公司；

微波炉：MW20-M605型，格兰仕微波炉电器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV5000型，安徽皖仪科技有限公司；

电热恒温水浴锅：HH-4型，上海一恒科学仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：双A型，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发仪：N-1001型，上海泉杰仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌锅：LDZX-758KB型，上海申安医疗器械厂；

恒温振荡培养箱：SPX型，波东南仪器有限公司；

冷冻干燥仪：ZX-LGJ-IA型，上海知信实验仪器技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的建立 参照王远[10]的方法，得到线性回归方程y=9.55x+0.000 3，R2= 0.999 4。

1.3.2 辣木叶总黄酮提取 将辣木叶阴干后粉碎，过60目筛。称取适量辣木叶粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，回流提取2 h，抽滤烘干后即得辣木叶脱脂粉末。精确称取1.00 g辣木叶脱脂粉末进行微波辅助提取。

1.3.3 单因素试验 设定料液比为1∶25 (g/mL)，微波功率为406 W，微波时间为4 min，乙醇体积分数为50%，固定其他条件，分别考察料液比、微波功率、微波时间、乙醇体积分数对辣木叶总黄酮得率的影响。

1.3.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计响应面试验。

1.3.5 辣木叶总黄酮含量测定 移取提取液1.0 mL，测定510 nm处吸光度，重复3次，按式(1)计算总黄酮含量。

(1)

式中：

X——辣木叶总黄酮提取率，%；

C——总黄酮质量浓度，mg/mL；

V1——定容体积，mL；

V2——显色反应时定容体积，mL；

m——辣木粉质量，g；

V0——吸取提取液体积，mL。

1.3.6 抑菌活性测定 参照杨丽华等[26]的方法。

1.3.7 抗氧化活性测定

(1) DPPH·清除能力：参照杨丽华等[26]的方法。

(2) ABTS+·清除能力：参照岳秀洁等[17]的方法。

(3) ·OH清除能力：参照王娟等[27]的方法。

1.3.8 数据处理 各试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析和IC50值计算，采用Design-Expert 8.0.6.1软件分析响应面试验数据。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知，随着料液比、微波功率、微波时间和乙醇体积分数的升高，辣木叶总黄酮提取率均呈先升高后降低的趋势。这是因为随着料液比的增加，辣木叶粉末与溶剂的接触更充分，总黄酮提取率逐渐提高，但料液比增大到一定程度后，总黄酮已基本溶出，再增加料液比会导致其他可溶性杂质与黄酮类化合物竞争溶剂，导致提取率下降[17，28]。微波功率较低、微波时间过短时，总黄酮溶出不完全，反之则会破坏黄酮类化合物的结构[28-29]。乙醇体积分数的增加会造成溶剂的极性下降，乙醇体积分数较低时会导致水溶性物质溶出，乙醇体积分数过高时会导致脂溶性成分溶出，从而降低辣木叶总黄酮提取率[30]。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 响应面试验

在单因素试验基础上，选择料液比、微波功率、微波时间和乙醇体积分数为因素，以辣木叶总黄酮提取率为响应值进行响应面试验优化，各因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平表

采用Design-Expert 8.0.6.1进行分析，得到辣木叶总黄酮提取率与各因素的回归方程模型为：

Y=7.32-0.23A-0.046B-0.073C-0.045D+0.071AB+4.250E-003AC-0.09AD+4.656E-003BC-3.938E-004BD+0.052CD-0.20A2-0.22B2-0.099C2-0.34D2。

(2)

由表3可知，模型P<0.000 1，极显著，失拟项P=0.534 4>0.05，不显著，表明所得回归方程拟合较好，回归性显著。模型中A、C、A2、B2、C2、D2对响应值的影响极显著(P<0.01)，B、D、AD对响应值的影响显著(P<0.05)。各因素对响应值的影响从大到小依次为料液比>微波时间>微波功率>乙醇体积分数。

表3 Box-Behnken试验结果方差分析†

根据响应面分析得到最佳工艺条件为料液比1∶28.84 (g/mL)、微波功率521.88 W、微波时间3.61 min、乙醇体积分数49.86%，此条件下辣木叶总黄酮提取率预测值为7.411%。为了便于操作，将最佳提取工艺调整为料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波时间3.6 min、乙醇体积分数50%，此条件下辣木叶总黄酮实测提取率为(7.414±0.027)%，与理论值接近，说明模型拟合良好，工艺合理可行。

研究[31-33]表明，辣木叶中的营养成分含量与品种、产地、采收时期和样品干燥方式等密切相关，试验中辣木叶总黄酮的提取率高于前人[10,12-13,15-20,22]，可能与辣木叶的产地、干燥方式、采收时期和提取条件等有关。

2.3 抑菌活性

抑菌圈直径大小可以反映供试菌种对总黄酮的敏感程度，参照藿归国等[34]的方法可划分为高度敏感(直径>20 mm)、敏感(直径14～20 mm)、中度敏感(直径8～14 mm)和不敏感(直径<8 mm[30])。由表4可知，辣木叶总黄酮对3种供试菌种的抑菌活性有显著差异(P<0.05)，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌对辣木叶总黄酮中度敏感，金黄色葡萄球菌对辣木叶总黄酮不敏感。辣木叶总黄酮提取液对枯草芽孢杆菌的抑制效果最佳，抑菌圈直径为(10.64±0.04) mm，显著高于大肠杆菌，对金黄色葡萄球菌基本无抑制效果。

表4 辣木叶总黄酮的抑菌圈直径†

研究[35]表明，黄酮类化合物具有较强的抑菌活性，如槲皮素-3-O-葡糖苷及各种槲皮素苷、山奈酚及其衍生物、芹菜素、儿茶素等具有抑菌作用，这些化合物已在辣木叶总黄酮中被鉴定出[9-11]。王丽虹等[23]研究表明，辣木叶醇提物及其乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用。郭妍等[11]研究表明，5～500 μg/mL的辣木叶黄酮对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，对大肠杆菌无抑制效果。马金魁等[14]研究表明，辣木叶总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果，抑菌圈直径分别为(17.30±0.01)，(16.20±0.10)，(12.50±0.10)mm。王远[10]研究表明辣木叶总黄酮的抑菌效果受到纯化与否及辣木叶总黄酮质量浓度的影响。以上结果与试验结果有差异，可能与辣木叶总黄酮溶液的质量浓度以及黄酮类单体成分的组成不同有关。

2.4 抗氧化活性

由图2可知，随着提取物质量浓度的增大，DPPH·和ABTS+·的清除率逐渐上升，但均低于相同质量浓度的抗坏血酸。当样品质量浓度为0.02～0.10 mg/mL时，随着辣木叶总黄酮质量浓度的增加，其对·OH的清除率几乎呈线性上升。当辣木叶总黄酮质量浓度为0.02～0.06 mg/mL时，其对·OH的清除率低于同质量浓度的抗坏血酸，当辣木叶总黄酮质量浓度>0.08 mg/mL时，其对·OH的清除率高于抗坏血酸，说明高浓度的提取物对·OH的清除效果较好。抗坏血酸对DPPH·、 ABTS+·和·OH的IC50值分别为0.007，0.001，0.047 mg/mL，而辣木叶总黄酮对应的IC50值分别为0.024，0.014，0.051 mg/mL，分别为抗坏血酸的3.43，14.00，1.09倍。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

3 结论

通过Box-Behnken中心组合设计四因素三水平的响应面试验，得到微波辅助提取辣木叶总黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波时间3.6 min、乙醇体积分数50%，此条件下辣木叶总黄酮提取率为(7.414±0.027)%。与传统的溶剂浸提相比，试验方法具有提取时间短、提取率高的特点。抑菌活性试验结果表明，辣木叶总黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有不同程度的抑菌作用，属于中度敏感，对金黄色葡萄球菌几乎无抑制作用。抗氧化试验结果表明，辣木叶总黄酮对体外DPPH·、·OH、ABTS+·清除的半抑制浓度分别为0.024，0.051，0.014 mg/mL，说明其具有较强的抗氧化活性。试验所选取的供试菌种和抗氧化方法较少，对辣木叶总黄酮的抑菌和抗氧化活性评价还不够全面，后续应选用更多的菌种和不同原理的抗氧化方法进行试验，并对抑菌和抗氧化活性的机理进行探索。此外，不同的黄酮类化合物单体的抑菌和抗氧化能力不同，多种黄酮类化合物单体联用会形成协同或拮抗作用。试验中的辣木叶总黄酮为粗提物，具体的黄酮类单体成分及含量尚不明确，还需进一步研究。